GFP基因的克隆与表达操作步骤.pdf

GFP基因的克隆与表达 一、碱裂解法质粒DNA 的小量提取 所涉及溶液的配制： Solution Ⅰ： 50mmol 葡萄糖 25mmol Tris Cl (pH8.0) 10mmol EDTA (pH8.0) Solution Ⅱ： 0.2mol NaOH 1% SDS 使用前现配现用 Solution Ⅲ： 每100ml含： 5M KAC 60.0ml 冰乙酸 11.5ml 蒸馏水 28.5ml TE Buffer ： 10mmol Tris Cl (pH8.0) 1mmol EDTA (pH8.0) （1） 取单菌落于5ml带有相应抗生素的液体LB培养基中，于 37℃、200-250rpm振荡培养过夜 （农杆菌在YEB培养基 中，于28℃、250rpm振荡培养，时间相对长些）； （2 ） 将1.5ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于 4 ℃、12000rpm离心1分钟，吸弃上清 （可重复一次，若 菌种需要保存，需要在无菌条件下操作）； （3 ） 向离心管中加入100 －150l用冰预冷的Solution Ⅰ，用旋 涡振荡器或用微量移液器吹打重悬沉淀； （4 ） 加入200l新配制的Solution Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心 管5次 （注意动作幅度不要太大），冰上放置5分钟(仔细 观察加入Solution Ⅱ后有何现象出现？) ； （5 ） 加入150l用冰预冷的Solution Ⅲ，轻轻混匀 （观察有何现 象出现？），冰上放置3~5分钟； （6 ） 用微量离心机于4 ℃、12000rpm离心5分钟，将上清转移 到另一离心管； （7 ） 加等体积酚、酚:氯仿(1:1) 、氯仿抽提，振荡混匀，用微 量离心机于4 ℃、12000rpm离心2分钟，将上清转移到另 一离心管中； （8 ） 向上清中加入2倍体积的无水乙醇，混匀后，于室温放置 2分钟；用微量离心机于4 ℃、12000rpm离心5分钟，弃 上清 （9 ） 用70% 乙醇洗涤1~2次，再次4 ℃、12000rpm离心5分钟， 沉淀于空气中干燥10分钟；用适量TE buffer溶解质粒 DNA ，加入1l 10mg/ml RNA酶，37℃处理1小时后使用 或于-20℃贮存。 二、DNA 的琼脂糖凝胶电泳 1．50xTAE(50倍体积的TAE贮存液) 配1000mL 50xTAE ： Tris 242 g 冰醋酸 57 mL 0.5mol ／L EDTA 200 mL pH 8.0 2 ．凝胶加样缓冲液(6x) 溴酚蓝 0.25 ％ 蔗糖 40 ％ 3 ．琼脂糖 4 ．溴化乙锭溶液(EB) 0.5µg ／mL 5 ． DNA 分子量标准