第7章蛋白质分离纯化.pptVIP

密度梯度（区带）离心 4－蛋白质的分离纯化 第三十一页，共六十五页。 密度梯度（区带）离心 4－蛋白质的分离纯化 第三十二页，共六十五页。 凝胶过滤 凝胶过滤层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。 凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。 当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。 分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。 4－蛋白质的分离纯化 第三十三页，共六十五页。 凝胶过滤（分子排阻层析） 基于分子大小 4－蛋白质的分离纯化 第三十四页，共六十五页。 利用溶解度差别的纯化 等电点沉淀（等电点时静电荷为零，相邻蛋白质分子间没有静电斥力而趋于聚集沉淀） 盐析与盐溶（中性盐可以增加蛋白质的溶解度，称为盐溶；盐析作用主要是大量中性盐争夺蛋白质疏水表面水分子） 有机溶剂分级分离（有机溶剂降低蛋白质表面可解离基团的离子化程度，促进蛋白质的聚集和沉淀） 4－蛋白质的分离纯化 第三十五页，共六十五页。 利用溶解度差别的纯化 分级沉淀（盐或有机溶剂） 4－蛋白质的分离纯化 第三十六页，共六十五页。 利用电荷差别的纯化 聚丙烯酰胺凝胶电泳 等电聚焦 离子交换层析 层析聚焦 4－蛋白质的分离纯化 第三十七页，共六十五页。 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 平板电泳 4－蛋白质的分离纯化 第三十八页，共六十五页。 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 管状电泳图谱 平板PAGE图谱 4－蛋白质的分离纯化 第三十九页，共六十五页。 等电聚焦电泳 蛋白质是带有电荷的两性生物大分子，其正负电荷的数量随所处环境酸碱度的变化而变化 。在电场存在下的一定pH溶液中，带正电的蛋白分子将向负极移动而带负电的蛋白分子将向正极移动，在某一pH时，蛋白分子在电场中不再移动，此时的pH值即为该蛋白质的等电点。 等电聚焦(IEF）电泳就是在凝胶中加入两性电解质从而构成从正极到负极pH逐渐增加的pH梯度，处在其中的蛋白分子在电场的作用下运动，最后各自停留在其等电点的位置上，测出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等电点。 4－蛋白质的分离纯化 第四十页，共六十五页。 等电聚焦电泳 蛋白质在具有pH梯度的介质中电泳 4－蛋白质的分离纯化 第四十一页，共六十五页。 等电聚焦电泳 4－蛋白质的分离纯化 第四十二页，共六十五页。 二维电泳 1975年，O’Farrell 首先运用双向电泳技术将大肠杆菌总蛋白分离出1100多个蛋白点。后来此技术一直用于原核生物和真核生物总蛋白的分离。目前，随着蛋白组工程的发展，双向电泳技术越来越广泛的用于发现未知蛋白。 二维电泳由第一向等电聚焦(IEF)电泳和第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)组成，第一向使等电点不同的蛋白得到分离，第二向使分子量不同的蛋白得到分离，两向结合便得到高分辨率的蛋白图谱。 4－蛋白质的分离纯化 第四十三页，共六十五页。 二维电泳 Isoelectric focusing is often combined with SDSto generate two dimensional gels. 4－蛋白质的分离纯化 第四十四页，共六十五页。 二维电泳的应用示例 4－蛋白质的分离纯化 第四十五页，共六十五页。 离子交换层析 阳离子交换剂： CM-纤维素：-O-CH2COOH P-纤维素：磷酸基 阴离子交换剂： DEAE-纤维素：二乙基氨基乙基 AE-纤维素：氨基乙基 4－蛋白质的分离纯化 第四十六页，共六十五页。 蛋白质的分离纯化与表征 蛋白质的酸碱性质 蛋白质分子的大小与形状 蛋白质胶体与沉淀 蛋白质分离纯化的一般原则 蛋白质分离纯化的方法 蛋白质含量测定与纯度鉴定 第七章 蛋白质的分离纯化与表征 第一页，共六十五页。 蛋白质的酸碱性质 蛋白质中可解离的基团 蛋白质的等电点 1－蛋白质的酸碱性质 第二页，共六十五页。 蛋白质中可解离的基团 -NH3+ pKa=7.6~8.4 -COO- pKa=3~3.2 Next Page 1－蛋白质的酸碱性质 第三页，共六十五页。 蛋白质中可解离的基团 -COO- pKa=3.0~4.7 -COO- pKa=4.4 1－蛋白质的酸碱性质 第四页，共六十五页。 蛋白质中可解离的基团 pKa=5.6~7.0 -NH2 pKa=9.4~10.6 1－蛋白质的酸碱性质 第五页，共六十五页。 蛋白质中可解离的基团 pKa=1