抗体的表达原理.pptVIP

3、筛选标记基因 是细胞产生特定的药物抗性或产生荧光。 常用的筛选标记有： 氨基糖苷转移酶（APH或neor），潮霉素B磷酸转移酶（hyg），二氢叶酸还原酶（dhfr）等 * 精品课件资料 4、外源基因在哺乳动物细胞中的表达方式 瞬时转染： 永久转染 * 精品课件资料 启动子下游的SD序列 启动子下游需有SD(Shine and Dalgarno)序列，这段序列是核糖体结合位点(RBS)的一部分．研究发现SD序列为UAAGGAGG时比AAGGA翻译效率高，起始密码子ATG与SD序列UAAGGAGG的最适距离为6-8bP，与A AGGA的距离5-7bP为好，在分泌表达时需要有前导序列，大肠杆菌中比较常用的几种前导肽序列为pelB(果胶酶基因)、OmpA(外膜蛋白基因)、OmpF等 ，使用何种前导肽对产量影响并不大。 * 精品课件资料 解释SD序列 SD序列（Shine-Dalgarno sequence）：mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。 原核生物中，核糖体受一段富含嘌呤的SD序列引导从而识别AUG起始密码。这段位于AUG上游的序列和30S核糖体亚基的16s rRNA一段序列互补，保守区5-UAAGGAGGUGA-3，核糖体结合位点RBS和起始密码AUG之间的距离以及碱基的组成对翻译的效率有显著影响，在设计的时候要注意。而真核生物的那段保守序列成为Kozak序列（5-GCCACCAUGG-3），要高效翻译，+1G和-3A就很重要。不过如果mRNA没有这段Kozak序列而有一段适当长度5UTR也能够有效地在无细胞体系中得到翻译。有趣的是，还有数据提示，大肠杆菌的核糖体通常只认得SD序列，而真核比如网织红细胞的核糖体能识别Kozak序列，也能识别SD序列。 * 精品课件资料 * 精品课件资料 表达产物中需要加入tag 在表达产物中加入标签序列(tag squence)后可以方便地利用ELISA等常规的免疫学方法进行活性检测、定量及亲和层析纯化产物；通常这段标签位点都置于产物的C-末端，这样一般不会影响抗体片段的活性，在进行直接ELISA时也能保持标签位点的活性。目前常用的标签序列有组氨酸串、FLAG、c-myc10肽及Strep标签。组氨酸串为5-6个组氨酸，它可以与Ni+、Zn2+及Co+等阳离子结合，因此带有His的抗体片段可以通过金属螯合层析 * 精品课件资料 * 精品课件资料 富集、纯化。疏水性多肽序列DYKDDDDK被称为“FLAG”．也可用于检测和纯化重组蛋白， 它的特点是既可置于N末端，又可置于C末端。C-myc10肽是鼠单克隆抗体9E10的结合表 位．该标签的特点是特异件很高。Strep是一段合成的9肽，其序列为AWRHPQFGG，它能与 链亲合素(streptavidin)结合，用于柱层析纯化，其不足之处是只能连于C末端。经改进的strep tag II (SNWSHPQFEK)的亲和力有所降低，但可以连于N端发挥作用。 * 精品课件资料 二、重组抗体片段的可溶表达 由于可溶表达的抗体可能对宿主菌产生毒性，因此可溶表达载体应选用严格调控的诱导 型启动子来降低本底，过强的启动子因为对大肠杆菌的分泌、加工能力要求过高而并不能增 加分泌表达的产量，有时甚至会降低可溶表达的产量，诱导的强度和持续时间也会影响产物的正确折叠，多数情况下可以利用降低温度来增加可溶表达的产量，经验值为24-32度。 * 精品课件资料 * 精品课件资料 (一)可溶表达的实验方案 从新鲜涂布的平板上挑取单菌落，在起始培养基中培养后转接入50ml含抗生素的丰富培养基(2YT或LB)中培养，如果要进行更大体积的培养，则应将单菌落接种在4ml丰富培养基中37度培养4-8h，然后再以此培养基转接至大量培养基。如需过夜培养应该在30度或更低温度下培养，而不宜在37度培养过夜。诱导在37度培养至OD600约为0.4-1.0时开始进行。诱导条件因启动子不同而异，参见表7-2。加入诱导物后继续振荡培养3h或过夜培养．诱导进行的时间取决于启动子的特性和诱导温度。以下列出不同温度下诱导培养的时间的经验值：15-25度过夜诱导、30度诱导5-6h或更长时间、37度诱导3-4h。 * 精品课件资料 （二）可溶表达条件的优化 1 质粒拷贝数 （适中） 2 mRNA的数量与蛋白质的稳定性 3 抗体片断的折叠与组装 * 精品课件资料 第三节 抗体在酵母及昆虫细胞中的表达 一、昆虫表达系统及其在基因工程抗体中的应用 1 以重组杆状病毒为载体的昆虫表达系 统。 2 杆状病毒表达载体（宿主细胞为sf9） 3 杆状病毒表达系统的效率与加工能力 4 稳定