分子生物学 总RNA的提取和RT-PCR.ppt

4. RNA的漂洗 加500微升75％乙醇洗涤沉淀一次，轻轻上下颠倒洗涤， 12000g离心5min,弃去乙醇. 5. RNA的再溶解 空气干燥RNA沉淀，注意不要完全干燥，加入10uL RNase-Free处理水，充分溶解。 PCR仪设定的反应条件： 94oC 45 S DNA变性 55 oC 45 S DNA复性 72 oC 1 min 产物链延伸 25-30个循环后 72 oC 10 min 根据待扩增基因片段的长短确定具体反应条件，一般情况下，基因片段在500-1000bp左右时，可按下列条件进行PCR。 PCR仪介绍： 如果上盖加热的PCR仪，可以直接放入仪器中进行PCR； 如果下面加热的PCR仪，加入2滴矿物油后，加入仪器中，不过这种仪器现在已经很少用到。 PCR反应期间讲解： 1：20~3：00 PCR仪内发生的反应 1）对于定性分析特定基因在不同样本中的表达情 况时，一定要防止污染，尤其是PCR产物的污 染，为了排除假阳性结果，各种对照是必不可 少的。 2）模板不是越多越好，模板过多，当引物与模板 退火时会发生模板先互补结合，引物无法与模 板结合，因此，适量模板量是非常重要的。 模板过多还能大量消耗镁离子。 PCR反应注意事项： 根据待扩增基因片段的大小确定延伸时间，小于500bp，一般采用1分钟即可，大于500bp，可采用2分钟，但一般超过2000bp，一般可适当延长延伸时间2-3分钟。 变性 温度一般选用94?1oC，变性时间可根据模板大小和浓度确定，一般采用30秒。 退火 温度与引物序列关系非常密切，退火时间与引物长度和GC含量有关。 引物长度一般在15-25bp之间。 Tm=4(G+C)+2(A+T) 如何确定PCR的变性、退火和延伸温度和时间？ 1.为什么要加入镁离子？ 镁离子是Taq DNA聚合酶的辅酶，2.0mM的浓度时酶活性最高。镁离子能够和负离子集团结合，在PCR反应中，模板DNA、引物DNA、dNTP均可和镁离子结合，尤以dNTP影响最大。一般镁离子应比dNTP高0.5-1.0mM。 2.dNTP的浓度对PCR有什么影响？ dNTP浓度过高，除容易引起碱基错配外，还可结合镁离子。 3.为什么有时候需要进行热启动？ 热启动就是让DNA在变性温度下开始，Taq DNA聚合酶在DNA双链充分打开之后再加入PCR反应体系中，这样可以保证模板DNA变性充分，引物结合顺利并特异。 PCR反应相关问题： 4、DNA聚合酶： 1）Taq DNA聚合酶的特性: 半衰期：95oC ，40分钟 活 性：5`--3`方向的聚合酶活性。 5`--3`外切酶活性。 缺乏3`--5`外切酶活性。 因此没有校正功能。 2）Vent-TM DNA聚合酶： 半衰期：100 oC ，95分钟 活 性：还具有3`--5`外切酶活性。 引物设计 引物的设计：使用引物设计软件NTI 9.0,PRIME 5.0等 长度一般最低不少于16个核苷酸，而最高不超过30个核苷酸，最佳长度为18～21个核苷酸。有时可在5’端添加不与模板互补的序列，如限制性酶切位点等，以完成基因克隆和其它特殊需要。 两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端，即使无法避免，其3’端互补碱基也不应大于2个碱基，否则易生成“引物二聚体”或“引物二倍体”（Primer dimer）。 引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其是发夹结构（hairpin structures）。 (G+C）%含量:引物的组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中（G+C）%含量应尽量相似。 引物的合成：找专门的生物公司进行引物合成 引物的特异性： 引物的设计与合成对 PCR 的成功与否起着决定性的作用 引物的浓度： 引物量太低，则产物量降低，会出现假阴性 引物浓度过高会促进引物的错误引导非特