叶绿素a测定修订版本.docxVIP

1 / 5 实验三 富营养化湖中藻量的测定(叶绿素 a 法) 一、实验目的 富营养化湖由于水体受到污染，尤以氮磷为甚，致使其中的藻 类旺 盛生长。此类水体中代表藻类的叶绿素 a 浓度常大于 10 微克 / 升。 本实验通过测定不同水体中藻类叶绿素 a 浓度，以考查其富营养化 情 况。 二、器材与用品 1 、 分光光度计(波长选择大于 750nm 精度为 0.5 — 2nm)。 2 、 比色杯( 1cm； 4cm)。 3 、 台式离心机( 3500r/min ) 4 、 离心管( 15ml 具刻度和塞子)；冰箱 5 、 匀浆器或小研钵。 6 、 蔡氏滤器；滤膜( 0.45 微克，直径 47mm)。 7 、 真空泵(最大压力不超过 300kpa)。 8 MgC 悬液： lg MgCQ 细粉悬于 100ml 蒸馏水中。 3 2 / 5 9 、 90％的丙酮溶液： 90 份丙酮＋ 10 份蒸馏水。 10 、 水样：两种不同污染程度的湖水水样各 2L. 三、方法和步骤 1 、 按浮游植物采样方法，湖泊、水库采样 500ml，池塘 300ml。采 样点及采水时间同“浮游植物” 。 2 、 清洗玻璃仪器：整个实验中所使用的玻璃仪器应全部用洗涤剂清 洗 干净，尤其应避免酸性条件下而引起的叶绿素 a 分解。 3 、 过滤水样；在蔡氏滤器上装好滤膜，每种测定水样取 50－500ml 减压过滤。待水样剩余若干毫升之前加入 0.2ml MgCQ 悬液、摇匀直 至 抽干水样。加入 MgCO 可增进藻细胞滞留在滤膜上，同时还可防止 提取 3 过程中叶绿素 a 被分解。如过滤后的载藻滤膜不能马上进行提 取处理， 应将其置于干燥器内，放冷(4C) 暗处保存，放置时间最 多不能超过 48 小时。 4 、 提取；将滤膜放于匀浆器或小研钵内，加 2-3ml90%的丙酮溶 液， 匀浆，以破碎藻细胞。然后用移液管将匀浆液移入刻度离心管 中，用 5ml90%丙酮冲洗 2 次，最后向离心管中补加 90%丙酮，使 管内总 体积为 1 0 m l 。塞紧塞子并在管子外部罩上遮光物，充分振 荡，放冰箱 避光提取 18- 24 小时。 5 、 离心：提取完毕后，置离心管于台式离心机上 3500r/min ，离心 3 / 5 10mi n,取出离心管，用移液管将上清液移入刻度离心管中，塞上塞 子， 3500r/min 在离心 10min 。正确记录提取液的体积。 6、测定光密度：藻类叶绿素 a 具有其独特的吸收光谱(663nn) ,因 此可以用分光光度法测其含量。用移液管将提取液移入 1cm 比色杯 中， 以 90％的丙酮溶液作为空白，分别在 750 、 663 、 645 、 630nn 波长 下测提取液的光密度值(0D。注意：样品提取的 0 氐值要求在 0.2 与 1.0 之间，如不在此范围内，应调换比色杯，或改变过滤水 样量。 OD 小于 663 0.2 时，应该用较宽的比色杯或增加水样量； OD 大于 1.0 时，可稀释 663 提取液或减少水样滤过量，使用 1cn 比色杯比 色。 7、叶绿素 a 浓度计算：将样品提取液在 663 、 645 、 630nn 波长下的 光密度值(OD 0 皿 OB )分别减去在 750nm 下的光密度值 63 。 ( OD ) , ，此值为非选择性本底物光吸收校正值。叶绿素 a 浓度计 750 算公式如下： (1)样品提取液中的叶绿素 a 浓度 Ca 为： Ca (微克/ 升) =11.64 ( 0 矗—OD ) — 2.16 ( O? — OD ) +0.1 5o 5 5o ( OD － OD 630 750 (1 ) 水样中叶绿素 a 浓度为： 叶绿素 a (微克/升) =Cax v/ (V x L) 4 / 5 叶绿素 a (微克/升) =Cax v/V x L Ca：样品提取液中叶绿素 a 浓度 (微克/升) v : 90%丙酮提取液体积 (ml) V:过滤水样的体积(L) L:比色杯宽度(cm) 四、实验报告 将测定结果记录于表 4 - 1 中 表 4— 1 测定结果 叶绿素 叶绿素 a (微克/ 升) 水样 A 湖水 B 湖水 OD 663 OD 645 OD 3o OD 5o 根据测定结果，参照表 4-1 中指标评