香豆素-3-羧酸荧光检测.pptVIP

一、实验目的 1．学习和掌握荧光光度分析方法 2．了解荧光分光光度计的结构及使用方法 荧光法测定香豆素-3-羧酸含量 基态S0 特征辐射 激发态S* 吸收光 激发光? ex ?E 荧光 发射光? em 二、实验原理 1.荧光的产生 S2 S1 S0 T1 吸 收 发 射 荧 光 发 射 磷 光 系间跨越 内转换 振动弛豫 能 量 l 2 l 1 l 3 外转换 l ?2 T2 内转换 振动弛豫 2、仪器结构流程 单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器 光源：氙灯 检测器：光电倍增管 思考题：荧光分光光度计与紫外分光光度计在结构上有什么主要区别？ 3、定量依据 荧光强度 If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率? ： If = ? Ia 由朗-比耳定律： Ia = I0(1-10-? l c ) If = ? I0(1-10-? l c ) = ? I0(1-e-2.3? l c ) 浓度很低时，将括号项近似处理后： If = 2.3 ? I0 ? l c = Kc 4. 定量方法 标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度 比较法： 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较 三、试剂与仪器 1．仪器： 荧光分光光度计，移液管，容量瓶，烧杯 2．试剂： 香豆素-3-羧酸，95%乙醇 四、实验步骤 1、试剂溶液的配制 标准溶液：准确称取100 mg香豆素-3-羧酸，95%乙醇溶解、定容100 mL容量瓶，摇匀， （班级共用一份）再逐级稀释 待测液：准确称取100.0 mg香豆素-3-羧酸，95%乙醇溶解、定容100 mL容量瓶，摇匀，稀释 四、实验步骤 2、荧光光谱测定 在300 ~ 600 nm波长范围内扫描荧光光谱，分别记录标准溶液和待测液的最大荧光强度 注：石英比色皿要润洗 3、制备的香豆素-3-羧酸的纯度计算 If = Kc