胚胎干细胞体外培养.docx

胚胎干细胞体外培养 (一)胚胎干细胞的来源 目前胚胎干细胞的主要来源有：①囊胚的 ICM 及受精卵发育至桑葚胚之前的早期胚胎细胞；②从胚胎生殖嵴及肠系膜中分离原始生殖细胞 PGCs 后培养建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells ，EG 细胞)，也具有 ESCs 的特性，可以分化为各种类型的成熟 细胞；③体细胞核转移(somatic cell nuclear transplantation，SCNT)至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。其中囊胚的ICM 最为常用。 (二)胚胎干细胞的分离 分离获取 ESCs 的时间：以既保证 ESCs 的全能性又要有足够的细胞数量为原则来 确定 ESCs 分离获取的最佳时间。以 ICM 为 ESCs 来源时：小鼠取 3～5 天囊胚；猪取 9～ 10 天囊胚；羊取 7～8 天囊胚；牛取 6～7 天桑葚胚或早期囊胚；人取 7～10 天囊胚。以PGCs 取 ES 细胞时：小鼠取12.5 天胎儿生殖嵴；大鼠可取10.5 天尿囊、中胚层组织块、 12.5 天背肠系膜或 13.5～14.5 天生殖嵴；牛取29～35 天胎儿生殖嵴；人取35～63 天的生殖嵴。 分离获取 ESCs 的方法：从 PGCs 分离 ESCs 的方法常为机械剪切与消化相结合法， 即把采取的胚胎组织充分剪碎，采用EDTA、EDTA/胰酶消化。 从囊胚分离 ICM 的方法主要有三种： 免疫外科学方法：体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经兔抗 JCR 小鼠脾脏细胞抗血清(抗 H-26)作用 30 分钟，移至 1∶6 稀释的新鲜豚鼠血清中作用 30 分钟，Hank’s 液冲洗，此时胚泡的滋养外胚层呈空泡状，用眼科手术刀挑去死了的滋养层细胞，留存 ICM 细胞用于培养。这种方法利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留 ICM 细胞进行培养。 组织培养法：在小鼠受精2.5 天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床，4～6 天后，由子宫冲取胚泡进行培养。结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞， 在培养皿底壁上铺展；而 ICM 细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代。Evans 和 Kaufman 采用这种方法第一个建立了小鼠 ESCs 系。 显微外科学方法：小鼠受精后 3～4 天，由子宫冲取胚泡，利用显微操作系统直接从胚泡中吸出 ICM 细胞进行培养。 由于免疫外科学方法需要特殊的试剂去除透明带和滋养层，易对内细胞群造成损伤，而显微外科学方法需要专门的仪器设备，且对人员的技术水平要求较高，均难以推广应用。组织培养法将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育过程，内细胞群增殖旺盛，较易获得胚胎干细胞样集落。 (三)胚胎干细胞的培养和建系 ESCs 的分离培养和建系是其得以应用的前提。ESCs 建系的原理是：将分离获取的ICM 或 PGCs 与饲养层共同培养，使之增殖而又保持其未分化状态，这样代代相传从而使 ESCs 成千上万的克隆。目前建立ESCs 系的方法有多种，常用方法包括以下过程：①原始ESCs 的获得：从受孕动物体内或体外受精卵培养中获得发育至桑葚胚或胚泡阶段的早期胚胎，用 机械法分离、胰酶或胶原酶消化桑葚胚或胚泡内细胞团得到原始ESCs 悬液。②ESCs 的传代培养：将原始 ESCs 悬液接种到经放射线照射或丝裂霉素 C 处理的成纤维细胞饲养层上进行培养。培养 1 周左右，发现典型的ESCs 集落，挑取细胞集落，用低浓度胰酶分散后， 进行传代培养，3～5 天传 1 次。经反复传代培养，可获得生长旺盛的高纯度 ESCs。③ESCs 的鉴定。 由于 ESCs 来源于分裂增殖非常活跃的早期胚胎细胞，所以维持其生长代谢所需的营养要充足，用于 ESCs 培养的饲养层细胞培养基含高糖和谷氨酰胺，同时加胎牛血清、新生牛血清、2-巯基乙醇。高糖的作用是提高 ESCs 的增殖速度，同时提供饲养层细胞生长所需的能量；谷氨酰胺作为细胞合成蛋白质与核酸的原料，是饲养层细胞培养基的必需品； 2-巯基乙醇的作用为促进胚胎细胞的分裂增殖，并可还原血清中的含硫化合物，防止过氧 化物对 ESCs 的损害。 胚胎干细胞的培养体系： 常规培养液：选择和配制高质量的培养基是体外培养ESCs 的基本要求。常用的培养基有 MEM-α、DMEM、TCM-199、F12 等合成培养基，以DMEM 应用最为普遍。再加入 10%新生牛血清、 10%胎牛血清、0.1mM 2-巯基乙醇、100μg/ml L-谷氨酰胺。 Thomson 等建立恒河猴(rhesus monkey)ESCs 系时，培养基中补加了 1%的非必需氨 基酸，结果 ESCs 生长良