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NTA vs. IDA：NTA和IDA的区别和选择– Cube Biotech 如果您正在使用固定化金属亲和层析（IMAC）纯化蛋白，您使用的金属离子很可能是通过次氮基三乙酸（NTA）或者亚氨基二乙酸(IDA)偶联到树脂基质上的。在众多可用于IMAC的螯合配体中，NTA和IDA是常用的两种。您更倾向于使用哪种螯合配体？您为何选择该配体？这两种配体有什么不同?为了帮助我们的客户在充分了解产品的情况下做出订购决定，我们以PureCube Ni-NTA 琼脂糖和PureCube Ni-IDA 琼脂糖为例，详细介绍二者的异同。 两种配体在结构上和化学上有何不同？螯合配体如何影响蛋白结合载量？金属离子在琼脂糖的亲和能力和特异性中扮演什么角色？NTA和IDA对氧化剂的反应如何？样品缓冲液中的螯合剂对NTA和IDA的影响有无不同？?NTA vs IDA: 两个配体的说明固定化金属亲和层析（IMAC）是一种常用的蛋白纯化方法，尤其是纯化带多聚组氨酸标签的重组蛋白。过渡金属离子通过螯合配体被固定在基质上，金属离子能与多聚组氨酸标签相互作用，有效地将带标签的重组蛋白从样品中纯化出来。目前商品化的琼脂糖中常用的两种配体便是NTA和IDA。在这份使用说明中，我们从已发表文章和实验中总结了两种配体的区别以及优缺点，以便为您提供一些思路，使您选择的琼脂糖能得到优秀的纯化结果。?利用金属捕获蛋白质固定化金属亲和层析（IMAC）解决通常的一步蛋白纯化从1975年IMAC问世以来，IMAC以及它的变型和改良技术被广泛地应用于蛋白纯化领域。通常情况下，过渡金属离子通过配体固定在基质上，与融合在肽段C-或N-末端的多聚组氨酸标签（由3-10个组氨酸组成）上的咪唑基相互作用。这种相互作用可以有效地将蛋白质从溶液中分离出来，然后通过一定浓度梯度的咪唑洗脱液、改变pH或金属螯合将结合的蛋白从金属离子上洗脱下来。 IMAC的初始用于纯化自身具有金属离子亲和性的天然蛋白质，现在已扩展到纯化磷酸化蛋白，抗体以及一系列带有多聚组氨酸标签的蛋白质。多聚组氨酸标签的突出优点在于它的体积较小，同时免疫原性很低，几乎不会干扰到蛋白质的正常功能。三价或四价离子通常用于磷酸化蛋白的纯化，而二价离子如Ni2+, Cu2+?和 Zn2+一般用于纯化带组氨酸标签的重组蛋白。 IMAC之所以能得到广泛应用，不仅因为它价格低廉，操作简单，还因为它非常稳定，在很多特殊的蛋白纯化情况中也可以使用。例如，我们需要在非变性或变性条件下纯化蛋白，或者在氧化及还原环境中纯化蛋白，都可以使用IMAC。另外，IMAC可耐受多种化学物质。总而言之，IMAC还具有高亲和性，高特异性和易放大性，这使得蛋白纯化甚至是从粗裂解液中纯化都变得非常有效。?不仅仅是蛋白纯化IMAC作为一种通用技术，其应用之广，非常惊人。表面固定化组氨酸标记抗原可增加以ELISA为基础的诊断工具的灵敏度。IMAC也可以介导功能域表面蛋白与蛋白相互作用的研究。在蛋白组学研究中，IMAC可用于预分离阶段来减少对象样品的复杂性。最后，利用螯合原理，样品与耦联螯合配体的基质一同孵育，配体可减少PCR的金属离子抑制剂，因此能快速产生用于扩增的样品。?选择螯合配体：选择哪一种？配体的配位数对洗脱蛋白的产量和纯度有影响Porath和同事发明了第一个IMAC琼脂糖实物，他们将金属离子通过亚氨基二乙酸（IDA）固定到琼脂糖上。现在商品化IMAC琼脂糖仍广泛使用IDA配体，次氮基三乙酸（NTA）在1987年被Hochuli和同事首次引入商品化IMAC中。在那之后，尽管有其他专用螯合配体(例如 TED, TALON?)陆续问世，但IDA和NTA一直代表最常用的亲和纯化蛋白IMAC琼脂糖。从结构上看，IDA与NTA的区别在于NTA多了一个羧甲基基团。从化学性质上看，额外的功能基团使得NTA与金属离子的配位能力更强，因为NTA拥有四个效价，而IDA只有三个（图1）。图1：IMAC螯合配体IDA和NTA. IDA和NTA广泛用于将过渡态金属离子结合到基质上，该整体可作为亲和树脂。这两种配体与金属离子结合的价态数目不同（IDA是三价而NTA是四价；价态用橙色标出），这会影响纯化到的蛋白的质量。?当两种配体都有两个价位可以与组氨酸残基的咪唑基相互作用时，配位数对纯化到的蛋白质量有影响。首先，作为一个三价配体（配位数为3），IDA的金属离子漏出率很高，尤其是在平衡和洗脱步骤。尽管NTA琼脂糖的洗脱成分中也含有部分漏出的金属离子，但明显少于IDA树脂。第二，由于目标蛋白性质的变化，用IDA琼脂糖纯化的带组氨酸标签的蛋白通常比用NTA琼脂糖纯化的纯度低。图2显示在大肠杆菌中表达的绿色荧光蛋白，分别用PureCube Ni-IDA和Pur