激光共聚焦技术讲解.pdfVIP

模块九 激光共聚焦技术 1.实验目的 让学生了解激光共聚焦显微镜硬件组成，掌握激光共聚焦显微镜常用的基本操作及注意事项， 能够熟练、准确地设计光路，重点掌握激光共聚焦显微镜测定细胞荧光信号动态变化的方法以及钙 2＋ 指示剂（fluo-3/AM）标记Ca 的基本原理与方法，了解激光共聚焦显微镜在生物学上的应用。 2. 实验原理 激光扫描共聚焦显微镜是采用激光为光源，在传统荧光显微镜成像的基础上，附加了激光扫描 装置和共轭聚焦装置，通过计算机控制来进行数字化图像采集和处理的系统。激光扫描共聚焦显微 镜系统主要包括扫描模块、激光光源、荧光显微镜、数字信号处理器、计算机以及图像输出设备等。 激光扫描共聚焦显微镜基本结构 （1）扫描模块 扫描模块主要由针孔光栏（控制光学切片的厚度）、分光镜（按波长改变光线传播方向）、发射 荧光分色器（选择一定波长范围的光进行检测）、检测器（光电倍增管）组成。 荧光样品中的混合荧光进入扫描器，经过检测针孔光栏、分光镜和分色器选择后，被分成各单 色荧光，分别在不同的荧光通道进行检测并形成相应的共焦图象，同时在计算机屏幕上可以显示几 个并列的单色荧光图象及其合成图象。 （2）荧光显微镜系统 激光扫描共聚焦显微镜所用的荧光显微镜大体与常规荧光显微镜相同，但又有其特点：需与扫 描器连接，使激光能进入显微镜物镜照射样品，并使样品发射的荧光到达检测器；需有光路转换装 置，即汞灯与激光转换，同时汞灯光线强度可调。 （3）常用激光器 激光扫描共聚焦显微镜使用的激光光源有单激光和多激光系统，常用的激光器包括以下三种类 型： 多谱线 Ar 离子激光器（氩离子激光器）：发射波长为458 nm、477 nm、488 nm、514 nm 的蓝绿 光；He-Ne 激光器（氦氖激光器）：发射波长为543 nm 的绿光和 633 nm 的红光；UV 激光器（紫外 激光器）：发射波长为351 nm、364 nm 的紫外光。 （4）辅助设备 风冷、水冷冷却系统及稳压电源。 激光扫描共聚焦显微镜的基本工作原理：激光扫描共聚焦显微镜的基本工作原理是首先由激光 器发射的一定波长的激发光，光线经放大后通过扫描器内的照明针孔光栏形成点光源，由物镜聚焦 于样品的焦平面上，样品上相应的被照射点受激发而发射出的荧光，通过检测孔光栏后，到达检测 器，并成像于计算机监视屏上。这样由焦平面上样品的的每一点的荧光图像组成了一幅完整的共焦 图像，称为光切片。 1 检测器 发射滤片 检测针孔光径 光线放大 检测分光镜 照明针孔光栏 激光器 物镜 z x 样品 背景 焦平面 激光聚焦点 F 激光共聚焦显微镜工作原理示意图 3. 实验仪器 激光共聚焦显微镜 4. 实验试剂 百合花粉萌发液体培养基：1.27 mM CaCl ；0.162 mM H BO ；0.99 mM KNO ；10% 蔗糖。 2 3 3 3 fluo-3/AM 荧光探针（DMSO 配制，贮存液浓度 1000 M ）。 5. 实验步骤 （1）激光共聚焦显微镜获得图象基本操作： 启动激光共聚焦显微镜、软件和激光器；在 VIS 模式中观察样品；转入LSM 配置；扫描图像； 数据存储 （2）激光共聚焦显微镜具体操作步骤： 开机步骤：接通系统总开关。显微镜、汞灯电源、温度控制器、除 UV 以外的激光器，平时可