质粒抽提原理及详细操作步骤.docxVIP

精选 精选 质粒抽提,实验室必备技能之 质粒 质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状 DNA分子。 质粒抽提 从细菌中分离质粒 DNA的方法包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细 菌；分离和纯化质粒 DNA。采用强碱液、加热或溶菌酶（主要针对革兰氏阳性细菌）可以 破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（ SDS ）和 Trito nX-100 （一般很少使用）可使细胞 膜裂解。经溶菌酶和 SDS或Triton X-100 处理后， 细菌染色体DNA会缠绕附着在 细胞碎片上，同时由于细菌染色体 DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被 切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体 DNA变性，而 共价闭合环状 DNA（Covalently closed circular DNA，简称cccDNA ）的两条链不会 相互分开。当外界条件恢复正常时， 线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质 和细胞碎片缠绕在一起， 而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子， 并以 溶解状态存在于液相中。 质粒抽提最常用的方法是碱裂解法， 它具有得率高、适用面广、快速和纯度高等特点。当然， 碱裂解法也有缺陷： 容易导致不可逆的变性。 要降低不可逆的变性， 就要控制好碱裂解的时 间。 碱裂解法抽提质粒需要用到以下三种溶液 溶液I PAGE # PAGE # 精选 50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris-CI ( pH 8.0 ),10 mmol/L EDTA ( pH 8.0 ), 在15 psi 压力下蒸汽灭菌15 min , 4 C保存。 溶液n 0.2 mmol/L NaOH（从10 mmol/L 贮存液中现用现稀释）， 10 g/L SDS （室温保 存）。 0.2 mmol/L NaOH 溶液川 5 mol/L 乙酸钾 60.0 mL ，冰乙酸 11.5 mL ，无菌水28.5 mL , 4 C保存，使用时 置于冰浴中。 下面介绍一下碱裂解法小提质粒 的具体操作： 01 柱平衡：向吸附柱中加入 500卩1平衡Buffer , 12000 rpm 离心30-60 s ，倒掉收集 管中的废液； 注意：吸附柱平衡后可最大限度激活硅基质膜， 提高质粒的得率；吸附柱平衡后应立即使用， 长时间放置会影响其吸附效果。 02 收菌：将过夜培养的菌液用 8000 g , 2-3 min 低温离心，吸弃液体培养基； 注意：高拷贝的质粒，需要 5-15 mL 的培养菌液；低拷贝的质粒，则需要 15-30 mL 的培养菌液；残留的液体培养基过多会影响细菌的裂解效果，应尽可能吸干培养基。 08精选 08 精选 向离心管中加入250卩I溶液I （加入RNase A ），吹匀菌沉淀并将悬液转移至新 1.5 mL EP管中； 注意：菌体悬浮不完全会导致裂解不完全，质粒提取量和纯度会降低。 04 向EP管中加入250 卩I溶液n （裂解Buffer ），温和翻转 EP管6-10 次，使菌体充 分裂解，液体变得澄清浓稠（开盖拉丝）； 注意：所用时间不宜超过 5 min，以免质粒被破坏；切勿剧烈震荡；液体未变得澄清，则 表明裂解不充分，可适当减少菌体量或增大 Buffer使用量；若溶液n出现浑浊，可 37 C 水浴几分钟，待液体恢复澄清即可使用。 05 向EP管中加入350卩l溶液川，温和翻转EP管6-10 次，此时可观察到管内出现白色 絮状沉淀，12000 rpm 室温离心10 min ； 注意：若上清中仍有少量白色絮状物，可再次离心 2-3 min 直至液体澄清。 06 将离心后上清转移至吸附柱中， 12000 rpm 离心30-60 s ，倒掉收集管中的废液； 07 可选：向吸附柱中加入 500卩l Buffer PD （富含蛋白酶），12000 rpm 离心1 min , 倒掉收集管中的废液； 注意：此步对富含内源核酸酶的宿主菌（ endA+ ）是必须的，对于 endA-宿主菌可省略。 PAGE # PAGE # 精选 向吸附柱中加入 600 （11 Wash Buffer （加入无水乙醇），12000 rpm 离心1 min , 倒掉收集管中的废液； 09 重复步骤8 一次； 10 将吸附柱和收集管放回离心机中， 12000 rpm 空转离心2 min ； 注意：此步骤非常关键，乙醇是否去除干净会影响后续的洗脱效率以及 PCR等效果。 1 1 将吸附柱转移至新的 1.5 mL EP 管中，拿到超净工作台中开盖鼓风吹 5-10 min ； 1 2 向吸附柱膜的中央滴加 40- 50 11预热Elution Buffer 或者DD水，关盖静置3-5