聚合酶链式反应.ppt

目录 目录 第1页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五 一、PCR的定义 在引物指导下由酶催化的对特定克隆或基因组DNA序列进行的体外扩增反应。 第2页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五 PCR技术的创建 Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术 1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。 第3页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五 Kary B. Mullis（1944－） 第4页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五 二、PCR技术的优点 特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等 能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍 第5页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五 三、PCR原理 Sample 1. denaturatation 2. Primer annealing 3. Primer extension Region to be copied 第6页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五 PCR技术原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 模板DNA变性：加热至94℃左右，双链DNA解离成单链； 模板DNA与引物的退火(复性)：55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 引物的延伸：在Taq DNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的双链； 重复循环变性--退火--延伸三过程，使DNA扩增量呈指数上升。 第7页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五 PCR的基本反应步骤 变性 95?C 延伸 72?C 退火 Tm-5?C 第8页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） PCR的基本原理 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA变性 形成2条单链 子链延伸 DNA加倍 第9页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 子链延伸 DNA加倍 DNA变性 形成2条单链 模板DNA 95℃ 第10页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 95℃ 50℃ 引物1 引物2 DNA引物 第11页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 50℃ 引物1 引物2 DNA引物 72℃ Taq酶 Taq酶 第12页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 72℃ 第1轮结束 95℃ 第2轮开始 第13页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 95℃ 50℃ 72℃ Taq Taq Taq Taq 第14页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 72℃ 第2轮结束 第15页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增 第3轮扩增 第4轮扩增 第5轮扩增 第6轮扩增 第16页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五 PCR product 第17页，共27页，2022年，5月20日，21点0分，星期五 Target Amplification No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 2