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关于聚合酶链反应 第1页，共42页，2022年，5月20日，21点0分，星期五 * 一.概 述 聚合酶链反应（ polymerase chain reaction,PCR),又称无细胞克隆技术，是一种特定DNA片段在体外快速扩增的新方法。 数小时达107-108倍 1985年，Centus公司Kary Mullis 发明 1993年因此获诺贝尔化学奖 第2页，共42页，2022年，5月20日，21点0分，星期五 * PCR扩增仪 第3页，共42页，2022年，5月20日，21点0分，星期五 * 变性 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 引物复性 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ P1 P2 第4页，共42页，2022年，5月20日，21点0分，星期五 * 延伸 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ P1 P2 再变性 第5页，共42页，2022年，5月20日，21点0分，星期五 * 再复性 P1 P1 P2 P2 再延伸 第6页，共42页，2022年，5月20日，21点0分，星期五 * P1 P1 P2 P2 短片段以指数形式扩增 长片段以线性形式扩增 最终主产物片段长度在P1-P2之间 第7页，共42页，2022年，5月20日，21点0分，星期五 * PCR循环的主要参数： 1. 预变性：92°C--95 °C， 2--5min 2. 变性： 92°C--95 °C，30s-1min 3. 复性： 40 °C--60 °C，20s--2min 4. 延伸： 70 °C--75 °C，30s--3min 5. 总延伸：72 °C， 7min 第8页，共42页，2022年，5月20日，21点0分，星期五 * 三、PCR的基本反应步骤 变性 95?C 延伸 72?C 退火 Tm-5?C 第9页，共42页，2022年，5月20日，21点0分，星期五 * PCR扩增条件 94℃, 5min 94℃, 1min 30 55℃, 1min 72℃, 1min 72℃, 7min 第10页，共42页，2022年，5月20日，21点0分，星期五 * 第11页，共42页，2022年，5月20日，21点0分，星期五 * DNA Marker NGF ←2000bp ←1000bp ←750bp ←500bp ←250bp ←100bp 第12页，共42页，2022年，5月20日，21点0分，星期五 * 第13页，共42页，2022年，5月20日，21点0分，星期五 * 第14页，共42页，2022年，5月20日，21点0分，星期五 * 第15页，共42页，2022年，5月20日，21点0分，星期五 * 三. PCR反应体系 缓冲液　提供所需的pH环境 DNA模板：欲扩增的DNA样品 dNTP： 四种脱氧核苷酸 MgCl2： 提供Mg++离子 引物： 根据欲扩增的DNA样品设计 耐热的DNA聚合酶： 来源于喜热的细菌 第16页，共42页，2022年，5月20日，21点0分，星期五 * 耐热的DNA聚合酶 Taq聚合酶 喜温性细菌 Thermus aquaticus BM 5→3聚合活性 5→3外切活性 Pwo聚合酶 喜温性细菌 Pyrococcys woesei 5→3聚合活性 3→5外切活性（校正） 耐热 1000C 2小时 Tth聚合酶 喜温性细菌 Thermus thermophilus 5→3聚合活性 当锰离子存在时具有逆转录酶活性 C.therm聚合酶 喜温性细菌 Thermus thermophilus 3→5外切活性（校正）当镁离子存在时具有逆转录酶活性 第17页，共42页，2022年，5月20日，21点0分，星期五 * 1.PCR buffer: 72?C 时，反应体系的pH值下降1个单位，接近于7.2 MgCl2 － 浓度1－2mmol/L，过量引起非特异