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威尼德方波与指数波电穿孔仪：电穿孔技术概述 威尼德生物科技（北京）（ biowleader ）,研发生产的双波全能型电 穿孔仪Gene Pulser X2通过高强度的电场作用,瞬时提高细胞膜的通透性，从而吸收周围 介质中的外源分子。这种技术将核甘酸、DNA与RNA、蛋白、糖类、染料以及病毒颗粒等 导入原核和真核细胞内。电转化相对于其它物理和化学转化方法，是一种有价值和有效的替 代方法。广泛用于植物、动物和微生物的各类细胞电穿孔。 电穿孔是利用跨膜电场脉冲在生物膜中诱导微观通路（孔）。它们的存在 允许分子、离子和水从膜的一侧传递到另一侧。当施加电场时，细胞膜内外的离 子迁移。当电荷积聚在膜的两侧时，膜会变弱，路径会允许材料进入外部要输入 的单元格的名称。如果电场被迅速移除，通道关闭，膜重新密封。如果电场持续 时间过长，那么路径增加，细胞被杀死。有效的电穿孔取决于合适的电极选择电场 波形。电孔主要位于离电极最近的膜区域上。这些路径大约在一微秒内形成，并 在几秒钟到几分钟内封闭。电场的持续时间是几十微秒到几十毫秒。20世纪80 年代初，诺依曼描述了电穿孔技术的应用。电穿孔的常规应用在20世纪80年代 一直受到研究人员的欢迎，因为它被发现是一种将药物或其他分子植入细胞的实 用方法。20世纪80年代末，科学家开始将电穿孔技术应用于多细胞组织。 20世纪90年代初，古斯塔夫?罗西研究所的Lluis Mir是第一个在人体试 验中使用电穿孔来治疗外部感染的人肿瘤。研究说明，路径的诱导受三个主要因 素的影响。首先，细胞间的生物变异性导致一些细胞比其他细胞对电穿孔更敏感。 其次，对于要诱导的路径，脉冲幅度和脉冲持续时间的乘积必须高于下限阈值。 第三，路径数量和有效路径直径随着“振幅”和“持续时间”的乘积而增加尽管还涉 及其他因素，但这一阈值现在人们认为，这在很大程度上取决于第四个因素，即 细胞大小的倒数。如果到达上限阈值，那么孔径和总孔面积对于电池来说太大通过 任何自发或生物过程进行修复，其结果是对细胞造成不可逆转的损害或细胞溶解。 由于对电穿孔的机理还没有很好的理解，因此针对特定应用的协议的开发已经开 始通常通过调整脉冲参数（振幅、持续时间、数量和脉冲间隔）以经验方式实现。 研究说明，特定的实验条件和电脉冲参数可能比简单的扩散能够导致更多的分子 在单位时间内移动。还有很好的证据（Sukharev等人，1992年）说明DNA运动 方向相反。当向电池和介质施加电压脉冲时，另一个重要考虑因素是，流动的电 流量取决于电池所在材料的导电性。有些材料导电性很强如果脉冲持续时间过长, 将发生加热。因此，长时间的磁场将通过破坏膜和加热杀死细胞。细胞所在的电 场由两个系统部件产生。第一个是电压波形发生器，第二个是将电压转换为电场 的电极。当电荷在膜（电容）处累积时，膜上的电压增加： 电压二电容电荷随着电荷在膜上积聚，膜上的电压增加。Neumann等人。（1989）描述了 将跨膜电压（TMV）与电场强度关联的方程式： TMV 3^2 = E r I cos a I 解释… E = electric field intensity in volts/cm r = the cell radius in cm a= angle off the center line当电压从零点几伏的静态值增加到0.5伏以上时，膜上会开始形成孔隙。要在半 径为711m的电池膜上产生1伏的TMV,所需的电场强度为： E=2. 1=950 伏/厘米“3，7 X 10-4. 随着脉冲幅度和脉冲持续时间的增加，孔数和有效孔径增加。在上限阈 值、孔径和总孔面积变得太大，细胞无法通过任何自发或生物过程进行 修复。结果是对细胞造成不可逆转的损害或细胞溶解。 乜 另一个重要的考虑因素是在电穿孔过程中产生热量。热量的产生与电流 强度直接相关而电流强度又取决于施加电场的材料的导电性。标准盐水 溶液（如PBS和许多组织培养基）具有很高的导电性，因此在细胞电穿 孔中使用时会产生大量热量。过度加热会损害细胞活力。在电穿孔之前， 使用低导电性介质重新悬浮细胞，可以减少加热的影响。虽然电穿孔是 将大分子引入细胞的一种有效方法，但细胞电穿孔的生物学机制还不完 全清楚。因此，为特定应用开发特定协议通常通过经验调整脉冲参数（即 振幅、持续时间、脉冲数和脉冲间隔）来实现。