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蛋白质双向电泳过程与体会 双向电泳IEF （sigma） IEF（not IPG）/SDS最简单的装备推荐如下，适合于没多少money做 IPG又想做“热”的所谓蛋白质组的，嘻嘻！ IEF用Biorad的圆盘电泳槽（不行用国产的吧，不推荐），SDS用六一厂的就可以了（ft, 六一厂应该给我money吧，给你做广告了）（money不是很多的强烈推荐六一的，买进口电泳 槽的钱留出来测搞出的差异蛋白质的序列吧，呵呵）BIO-RAD的圆盘电泳槽，国产的不推荐，因为上槽Biorad的钳金丝凹进去了 ?点，不是 很进去，而国产的凹得太进去了以至「?电聚焦时产生的气泡绕在钳金攵幺一圈，影响电聚焦。 双向电泳蛋白质样品制备 秧苗蛋白质样品的提取按Davermal等（1986）的方法进行。lOOmg材料剪碎后加入 10mgPVP-40（聚乙烯毗咯烷酮）及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5 ml 10%三氯乙酸（丙酮配制，含10mM 即 0.07% B - 蔬基乙醇），混匀,-20C沉淀1小时，4°C, 15000 r/min离心15 min,弃上清，沉淀复溶于 1.5ml冷丙酮（含10 mM6?疏基乙醇），再于-20C沉淀1小时，同上离心弃上清，（有必要再 用80%丙酮（含10 mM B ?筑基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。 按每mg干粉加入20ul（可调）UKS液[9.5 M尿素，5mM碳酸钾,1.25%SDS, 0.5%DTT（二硫 苏糖醇）,2% Ampholine （Amersham Pharmacia Biotech Inc, pH3.5-10）, 6% Triton X-100], 37°C 育30min,期间搅动儿次，28度（温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰）16000 r/min高心15 min,离心力越大时间长一点越好！上清即可上样电泳。或者-70度保存2蛋白质浓度测定 按Garrels（1983）的程序，稍加改动。10 u I ±述用UKS液制得的蛋白质样品中加入40」I水 及50 P I 20%三氯乙酸，冰浴30min后，4°C, 4000 r/min离心15min,弃上清，再加入100 P I冷丙酮，同上离心5min,弃上清，冻干獭，用100 口 I PBS溶液复溶，并按Bradford（1976） 的程序测定蛋白质浓度。说实话，好象Bradford法不太好做2.3.1 电聚焦（IEF） 玻管准备干7争玻管（18cmX1.5mm））IJ Parafilm封口膜封好底部，在16cm处作好标讪，垂直放在泡沫板 上。电聚焦的管子，买原装的也可以，实在不行自己也可以做的，1ml的移液管，内径1.5mm 左右的，长度取18cm,用玻璃刀做，呵呵，很容易的：玻璃管的处理，先用2M的NaOH泡 至少lhr,用自来水冲后;用双蒸水冲，用双蒸水泡至少Ihr,中间至少换2, 3次水;后用 2M的HCL泡至少1个小时，用双蒸水冲，（不能用自来水冲），然后双蒸水泡至少1个小 时，中间换3, 4次水，可多泡一会。最后泡在无水乙孵里 面lhr,轰干就可以用了. 凝胶制备与电聚焦灌IEF的配方 为3.09克尿素1.125 ml 10%NP-40 1.125ml 水0.735ml 30%屏息现案（ACR 28.38 BIS 1.62） 0.15 ml Am 3.5-100.375ml Am 5-7 8卫生10%AP1.8 卫生 TEMED 用注射器吸好胶液，装上7号针头，将7号针头插入玻管底部，边推注射器边提针头，直到 标记处，用微量进样器小心加入少量水，可见明显的界面出现，让其聚合1小时以I：,适当 长一点的时间好一些，我一般是头天卜,午灌胶，第2天卜?午才开始胞电泳。待胶聚合好后， 除去Parafilm并吸去顶部的覆盖液，加样80Ug,上面再小心加入50m mol/L NaOH至管口, 不要破坏样品与NaOH的界面。即可进行电泳。电极液为:上槽（负极）为50m mol/L NaOH液， 下槽（正极）为 25m mol/L H3PO4,按 200VX15min, 300VX30min, 400VX18h, lOOOVXlh 的程序进行电聚焦。或者直接 400V 17hr 1000V 2hr very important thing is跑第一向一定要在保持在37度左右，特别是冬天，我的方法是温控仪控制 暖风机在37度暖风机和电泳槽在 个大的纸箱（密封）里.呵呵，应该可以想象得到吧,第一 向温度特别重要，不然，电聚焦肯定做不好. 电泳后的凝条处理电聚焦完毕后，用注射器吸满水，套上一个200 ul的枪头，当然枪头与注射器间用parafilm 封住防漏气。从顶部向下注水使胶条向下滑出。当然，刚开始做的时候肯定不熟，很不爽， 有时候你会唱想哭却又哭不出来