食品加工技术课件-生产中常用菌种的分离、选育和保藏.pptVIP

第八节 原生质体育种 原生质体育种技术主要有原生质体融合、原生质体转化技术，此外尚有原生质体诱变育种等。 原生质休融合育种是基因重组的一种重要方法。 原生质体融合作为一种新的基因重组手段是1978年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上提出来的。 一、原生质体融合育种的特点 (一)杂交频率较高：细胞壁去除后在高渗条件下形成类似于球形的原生质体。 (二)受接合型或致育型的限制较小：二亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不同种属间微生物的杂交。 (三)遗传物质传递更为完整：原生质体融合是二亲株的细胞质和细胞核进行类似的合二为一的过程。 (四)存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合子的可能性。 （五有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株。 (六)提高菌株产量的潜力较大。 (七)有助于建立工业微生物转化体系。 二、原生质体融合育种步骤 1．标记菌株的筛选和稳定性验证。 2．原生质体制备。 3．等量原生质体加聚乙二醇促进融合。 4．涂布于再生培养基，再生出菌落。 5．选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏。 6．生产性能筛选。 三、原生质体融合育种的要点 （一）标记菌种的选择 获得标记菌种的方法是采用常规诱变育种，筛选出营养缺陷型或／和抗药性菌株。这里最重要的是标记必须稳定。 采用抗药性菌株除可作标记外，在实验室中还可排除杂菌污染的干扰。为的是确证融合的成功，可以采用多标记菌种。 (二)原生质体的制备 原生质体的制备主要是在高渗压溶液中加入细胞壁分解酶，将细胞壁分离剥离，结果剩下由原生质膜包住的类似球状的细胞，它保持原细胞的一切活性。 在放线菌和细菌中，制备原生质体主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蜗牛酶或纤维素酶等。 影响原生质体制备的因素 1．菌体的前处理 为了使酶作用的效果好一些，可将菌作一些前处理。如细菌加入亚抑制剂量的青霉素。 2．菌体的培养时间 为了使细胞易于原生质体化，一般选择增殖期的菌体。 3 ．酶浓度 对于不同种属的微生物，不仅对酶的种类要求不同，就是对酶的浓度也有差异。另外，最佳酶浓度还随不同的生长期的菌体而变化。 4．酶处理温度 5．破壁时的pH值 6．渗透压稳定剂 等渗透压在原生质体制备中，不仅起到保护原生质体免于膨裂，而且还有助于酶和底物的结合，渗透压稳定剂多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有机物和KCl和NaCl等无机物。 第九节 筛选新的代谢产物 一、开发新的代谢产物的途径 (1)从自然界分离新的微生物菌株，或采用新的检阅方法筛选新的代谢产物。 (2)对已知微生物的代谢产物进行化学修饰。 (3)利用微生物转化改造代谢产物的结构。 (4)通过原生质体融合获得新的代谢产物。 (5)DNA重组技术。 二、筛选微生物新的代谢产物的程序 4．当培养物OD600在o.5～o.8左右时，开始收获细胞(大约需2～2.5h)． 5．将培养物置冰浴中冷却10min。 6．取10ml培养物置2个冷离心管中弃去上清液。 7．加入1ml 0.1mol／L CaCl2，再加0.9ml CaCl2，置冰浴中放置20min。 8．3000r／min离心10min，弃去上清液． 9．加入1ml 0.1mol／L CaCl2，重新悬浮细胞，置冰浴中保存。 10．加入1～20μl待转化质粒 DNA溶液。 11．在冰上放置20min，在37℃处理2min。再插入冰中．加入0.9m1肉汤37℃静置培养90min。 12．以不同的量涂布选择培养基平板。 13．于37℃培养过夜。鉴定转化菌落。 常用的遗传转化系统 1、自然系统 2、人工诱导（完整细胞） （1）二价阳离子系统：Ca2+，Ca2++Mg2+，Mg2+，Ca2++辅助噬菌体，Tris+Ca 2+ （2）单价阳离子系统：PEG+Li+/Cs+/Rb+ （3）冻融系统 （4）Triton处理：人工诱导（PEG/原生质体） 重组DNA中常用的工具酶 包括限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、逆转录酶等. 限制性内切酶 切开DNA分子所需的酶：每一种酶都有其各自的作用位点。 常用限制性内切酶 种类及特性 W. Arber,H. O. Smith 限制性内切酶的剪切方式 粘性未端：切开后的两段DNA各留下一个尾，这2个尾的核苷酸顺序完全一样，中是方向相反。它们之间是互补的，在适当条件下可以再连接一起。 其它工具酶 连接酶 T4 DNA 修补工具酶 DNA聚合酶I 末端加工酶 S1核酸酶 ， 碱性磷酸单脂酶 末端转移酶 人工加polyA 或polyT 尾 反转录酶 载体－宿主系统 载体(vector)是携带外源DNA进入宿