聚丙烯酰胺凝胶电泳(修).pptVIP

☆ SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS） SDS是最常用的定性分析蛋白质的电 泳方法，特别适用于蛋白质纯度鉴定和分子量测 定。 SDS是在要进行电泳分析的样品中加 入了含阴离子表面活性剂 —— 十二烷基磺酸纳 （ SDS ）和 β - 巯基乙醇的样品处理液， SDS 可以断 开分子内和分子间的氢健，破坏蛋白质的二、三、 四级结构。 电泳样品加入处理液后，置沸水浴中煮沸 3~5 分钟，使 SDS 与蛋白质充分结合，引起蛋白质变 性、解聚、带上大量同种电荷，形成棒状结构。 样品液中通常加入溴酚蓝燃料，用于控制电泳过 程。此外，样品处理液中还加入了适量蔗糖或甘 油以增大溶液密度，便于加样时样品沉入样品凹 槽底部。 制备凝胶时首先要根据待分离样品的情况选 择适当的分离胶浓度，一般分离大分子量蛋白质 需要使用较低浓度的分离胶；分离小分子量蛋白 质需要使用较高浓度的分离胶。当分离胶聚合以 后，通常要在凝胶上面加上一层约 1cm 厚的浓缩 胶，并在浓缩胶上插入样品梳，形成上样凹槽。 浓缩胶的 pH 较低（通常 pH6.8 ）、胶浓度较低 （通常为 3~5% ），形成的孔径大，各种蛋白质都 可以自由通过，常用于样品进入分离胶前将样品 浓缩成很窄的区带。浓缩胶聚合后取出样品梳， 上样后通电即可电泳。 凝胶浓度与分离样品分子量的关系 总胶浓度（ % ） 分子量范围（ kDa ） 20 15 10 8 5 5~40 15~40 18~90 30~150 60~220 聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统即连续系统 与不连续系统，不连续系统中存在着三种不连续 即 pH 不连续、凝胶浓度不连续、溶液离子组成不 连续。样品在电泳过程中首先通过浓缩胶，在进 入分离胶前由于等速电泳现象而被浓缩。进入分 离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子 的蛋白质容易通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度 快；大分子的蛋白质则受到较大的阻力而被滞后， 这样蛋白质在电泳过程中就会根据各自分子量大 小而被分离。溴酚蓝指示剂为一种小分子物质， 可以自由通过凝胶孔径，用它显示电泳的前沿位 置。 实验仪器与试剂 （一）仪器 电泳仪、垂直板电泳槽、电 泳玻璃板，脱色摇床、真空泵、真空干燥 器、电加热磁力搅拌器、移液管、微量移 液器、烧杯等 （二）试剂 丙稀酰胺单体（丙稀酰胺、 甲叉双丙稀酰胺）；过硫酸铵（ AP ）：催 化剂；四甲基乙二胺（ TEMED ）：加速剂； 三羟甲基氨基甲烷（ Tris ）：配缓冲液。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 生物化学与分子生物学教研室 刘智敏教授 实 验 目 的 1. 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理； 2. 学习聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳法分离 血清蛋白 实 验 原 理 PAGE 的分类 PAGE 分离蛋白质的原理 PAGE 的优缺点及其用途 PAGE ） （一）什么是聚丙烯酰胺凝胶电泳（ （二） （三） （四） （一）什么是聚丙烯酰胺凝胶电泳 （ polyacrylaminde gel electrophoresis ， PAGE ） PAGE 是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介 质的一种常用电泳技术。 聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺和甲叉双丙 烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化 完成。 催化聚合的常用方法有两种：化学聚合 法和光聚合法。前者以过硫酸铵（ AP ）为 催化剂，以四甲基乙二胺（ TEMED ）为加 速剂。聚合过程中， TEMED 催化过硫酸铵 产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合， 同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生 甲叉键交联，从而形成三维网状结构。光 聚合法是以核黄素为催化剂，光照使核黄 素产生自由基从而诱发聚合反应。 聚丙烯酰胺凝胶的孔径可调，常通过改 变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度来进 行控制。低浓度凝胶具有较大的孔径，如 3% 的聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质没有明显的 阻碍作用，可用于平板等电聚集、 SDS 聚丙 烯酰胺凝胶电泳的浓缩胶或用于 DNA 分离。 高浓度凝胶孔径较小，对蛋白质有分子筛 的作用，一般用于不同分子量蛋白质的电 泳分离。 （二）聚丙烯酰胺凝胶电泳分类 1. 根据凝胶系统的均匀性，可分为连续性和 不连续性聚丙烯酰胺凝胶电泳。 连续性聚丙烯酰 胺凝胶电泳是指整个电泳系统中所用的凝胶网孔、 缓冲液及 pH 都是相同的，电泳时沿电泳方向的电 势梯度均匀分布，按常规区带电泳施加电压进行 操作，简单易行；不连续性聚丙烯酰胺凝胶电泳 是指系统中采用了两种或两种以上的缓冲液、 pH 和凝胶孔径，电泳过程中形成的电势梯度不均匀， 能将较稀的样品浓缩成密集的区带，从而提高分 辨率。 2. 根据凝胶溶液和电泳缓冲液对蛋白质构象 的影响，可分为变性电泳和非变性电泳两类。 前 者在缓冲系统中加入了 SDS 或尿素等蛋白变性剂， 在电泳前后，蛋白质都处