园艺植物基因的分离与克隆.ppt

第六十一页，共一百零二页，2022年，8月28日 Differential Hybridization cDNA library low density (~1,000/150mm) Replica plaque lifting mRNA (sample A) mRNA (sample B) labeled probe labeled probe hybridization 第六十二页，共一百零二页，2022年，8月28日 优缺点 优点 在基因序列未知的情况下，直接用来鉴定和克隆差异表达基因，具有简便、快速、RNA用量少、效率高等优点。 主要用于比较两种以上特定生理状态或不同发育阶段的mRNA样品间基因表达的差异。 缺点 假阳性特别高，可达70%，增加了后续工作的难度。 由于PCR 的敏感性，mRNA 差异显示技术重复性较差。 扩增片段较小(110～500 bp)，不能代表差异表达的基因。 只能扩增靠近Poly（A）mRNA 3’端不大于600 bp 的区域。 对高拷贝mRNA有较强的倾向性，不能用于低拷贝的mRNA。 第六十三页，共一百零二页，2022年，8月28日 二、抑制性消减杂交技术 原理 以抑制PCR为基础的cDNA消减杂交。 所谓抑制PCR是利用非目标基因片段两端的长方向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构，无法作为模板与引物配对，选择性地抑制了非目的基因片段的扩增。 第六十四页，共一百零二页，2022年，8月28日 基本步骤 提取含有目的基因的待测组织(tester)和不含目的基因的对照组织（driver)的mRNA，并反转录为cDNA。 用限制性内切酶将两种不同的cDNA切割为小片段。 将tester cDNA分为两份，分别连接不同的接头。 用过量的driver cDNA分别与这两种tester cDNA进行第一次消减杂交，会产生：单链tester、双链tester/tester、双链tester/driver、单链driver及双链driver /driver。 第六十五页，共一百零二页，2022年，8月28日 基本步骤 混合两份杂交样品，并加入新的变性driver cDNA进行第二次消减杂交，从而形成一种新的杂交组分，即分别含有不同接头的双链cDNA分子 （tester-adaptor 1/tester- adaptor 2）。 补平变性后分子的粘性末端。 以接头 1和接头 2序列为引物对其进行第一轮PCR。 用与接头内侧序列互补的另一对引物进行第二轮PCR，富集差异表达的目的基因片段。 用第二轮PCR产物构建相应的差减cDNA文库，克隆差异表达基因。 第六十六页，共一百零二页，2022年，8月28日 抑制性消减杂交技术示意图 第六十七页，共一百零二页，2022年，8月28日 优缺点 优点 假阳性率大大降低，阳性检出率为50%以上。 目的序列富集程度较高，且丰度相对一致，确保了低丰度表达的cDNA有被检测的可能，极大地提高了检测效率； 灵敏度很高，重复性强。 一次SSH实验中可同时富集上百个差别表达的基因，远远胜过DDRT-PCR。 缺点 需要较多的mRNA，因而某些特殊样本不容易获得。 更多地依赖于PCR技术，不能同时对多个材料进行比较。 材料之间存在过多的差异及小片段缺失也不能有效被检测。 第六十八页，共一百零二页，2022年，8月28日 三、代表性差异分析法 原理 以差减杂交为基础，从基因组水平筛选和克隆基因的方法。 充分利用了PCR反应中双引物以指数形式扩增双链模板，而单引物仅以线性形式扩增单链模板这一特性，并通过降低cDNA群体复杂性和多次更换cDNA两端接头等方法，特异地扩增目的基因片断。 第六十九页，共一百零二页，2022年，8月28日 基本步骤 分别提取试验组T和驱动组D的RNA并反转录成cDNA，然后加上接头，以接头特异性引物进行PCR扩增。 扩增产物经限制性酶切除去接头后，给T组酶切产物连上新的接头，使之区别于D组的cDNA。 用过量的D组酶切产物与经“修饰”过的T组cDNA混合，经变性、退火复性后形成T-D、T-T和D-D杂交分子。 利用T组新接头的特异接头引物进行PCR扩增，T-T同源杂交分子将得到有效扩增。 重复2～3次差减杂交步骤，尽可能去除共有序列，对差异表达基因片段进行更有效的富集。 克隆差异表达基因。 第七十页，共一百零二页，2022年，8月28日 优缺点 优点 免去了物理方法分离单、双链的繁琐操作，通过接头“修饰”设计，借助PCR技术即能使目的片段得到有效扩增，减少假阳性。 差减杂交在扩增后的cDNA群体之间进行，不再受供试的mRNA量的限制，拓宽了差减杂交的应用范围。 一次实验可分离得到多个在T组和D组间差异表达基因的cDNA克隆，并能发现与表型相关的异