酶联免疫吸附双抗体夹心法.docx

业精于勤荒于嬉,行成于思毁于随！ 精品文档，欢迎你阅读并下载！ 酶联免疫吸附双抗体夹心法 酶联免疫吸附双抗体夹心法优选酶联免疫吸附双抗体夹心法 一、实验目的1掌握酶联免疫吸附实验（ELISA）的原理2熟悉酶联免疫吸附实验的操作方法 二、实验原理?基础知识1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者VanWeerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)。ELISA现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术(immunoenzymatictechniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。 ?甲胎蛋白（αfetoprotein，AFP） 一种含4%碳水化合物的单链糖蛋白，分子量70KD，半衰期5天，由592个氨基酸残基的单肽链组成。基因位于第4对染色体4q1124q21区域，由15个外显子和14个内含子组成，属于血清中一种α球蛋白，是一种胚胎性相关蛋白。自1963年发现以来，作为一种肿瘤特异性抗原已广泛应用于临床。它对原发性肝癌的早期诊断具有重要意义，同时对肝细胞癌的鉴别诊断，流行病学调查和理论研究都很有价值。 ELISA的三条基本原理?原理一ELISA的基础是抗原（或抗体）的固相化及抗原（或抗体）的试加验底中物哪四些甲因基酶学素联标活可苯能胺记性会(T对M。。B实)验结结果合造成在影固响？相载体表面的抗原（或抗体）仍保持其免疫?原理二2熟悉酶联免疫吸附实验的操作方法(八)试验的重复性（精确度）试验中哪些因素可能会对实验结果造成影响？ (2)四甲基联苯胺抗(TM原B)(：或TMB抗是一体种脂)溶可性通较强过的基共团，价由于键这种与高酶度的连脂溶接性，形使其成易形酶成结多聚合体，物在H，RP活而性部此位种产生粗大的、辣深根蓝过色氧沉化淀物酶物酶结反(H应R合P后)呈物蓝色仍。能保持其免疫学和酶学活性。 ?原理三辣根过氧化物酶(HRP) 由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。 甲辣胎根蛋过白氧（化α物f酶e固t(oHpRr相Po)te上in，的AFP酶）量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶待测血清、抗反-A应FP-的L3抗底体、物封后闭蛋，白溶底液、物辣根被过氧酶化催物酶化（H成RP）为、底有物四色甲产基联物苯胺，（T产MB)物、显的色液量、终与止标液…本… 中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。 双抗体夹心法?方法用已知抗体包被，加入待测抗原，再加酶标抗体，加底物显色。固相(包被) 抗体Ab+样品(抗原Ag)+酶标抗体Ab*→Ab-Ag-Ab*+底物(TMB)→显色?应用这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位，因为其一端要与包被于固相载体上的抗体作用，而另一端则要与酶标记特异性抗体作用。 双抗体夹心法图示1、已知抗体包被于载体表面1、已知抗体被于载体表2、加肿瘤患者血清与抗体结合2、加健康人血与抗体结合EEE3、加酶标抗体与抗原结合EEE3、加酶标抗体无（少）抗原EEE4、加酶作用的底物4、加酶作用的产生较深蓝色无颜色或蓝色+ 双抗体夹心法测抗原- 三、实验仪器试剂v仪器全自动酶标仪、全自动酶标洗板机?试剂待测血清、抗-AFP-L3抗体、封闭蛋白溶液、辣根过氧化物酶（HRP）、底物四甲基联苯胺（TMB)、显色液、终止液……OR:甲胎蛋白（AFP）定量测定试剂盒（酶联免疫法） 四、实验步骤获得AFP未标定抗体将AFP抗体与固相载体连接形成固相抗体加入封闭蛋白溶液以封闭载体表面残留的蛋白结合位点洗涤除去未结合的抗体及杂质洗涤并除去未结合的封闭蛋白加血清形成固相抗体－抗原复合物洗涤除去其他未结合的物质加HRP酶标抗体生成抗体—待测抗原—酶标记抗体的复合物加底物四甲基联苯胺(TMB)进行酶催化反应彻底洗涤未结合的HRP酶标抗体根据颜色反应的程度进行AFP的定量测定详细步骤1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μ，混匀后从第七、第八孔中分别取5