细胞分子生物学课件.pptxVIP

基因工程载体;第一节;定义：指能有效运载外源DNA片段进入受体细胞内进行复制、扩增、传代乃至表达的自主复制的DNA分子 常用的载体： ① 质粒（plasmid）载体 ② 噬菌体(phage) 载体 ③ 病毒载体 ④ 其他载体 一般特点: ①能在宿主细胞中独立自主地复制 ② 容易从宿主细胞中分离纯化 ③ 有1非必需区域，插入外源基因后仍可进行复制和扩增 ④ 具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记 ⑤ 具有控制外源基因表达的启动子、阻遏子和终止子;二、原核细胞表达载体 ;4.分泌表达：除其他结构元件外，载体还有引领表达产物向细胞外分泌的信号肽序列，目的基因须与信号肽正确融合，表达产物位于细胞周质或培养液中，生物活性较强，便于分离纯化;原核细胞表达系统的优缺点： 优点：最早采用、最为成熟的表达系统，技术相对简单，能在较短时间内获得表达产物，所需成本较低 缺点：难以进行表达时间及水平的调控；有些外源基因的持续或过量表达可能对宿主菌产生毒害作用；缺乏真核细胞的翻译后加工修饰机制，表达产物多为不溶性包涵体，生物活性较低，纯化较难 ;三、真核细胞表达载体;基本结构特点： 多为整合型质粒，含酵母染色体同源序列，可整合入酵母染色体中 以酵母菌可诱导表达基因的强启动子控制外源基因的表达 多为大肠杆菌/酵母菌穿梭载体 2. 宿主菌：目前以毕赤酵母（Pichia Pastoris）应用最多 3. 转化方法：原生质体转化法，电击法，氯化锂法 4.优点：兼有原核细胞和真核细胞表达系统的优点，包括基因操作相对简单，表达水平较高（可达克级/L培养液），成本较低，翻译后加工接近哺乳动物细胞;基本结构：杆状病毒是常用的昆虫细胞表达载体，其中最常用的是苜蓿银纹夜蛾杆状病毒(AcNPV) ，传递质粒含核多角体基因强启动子 基本原理：将含外源基因的传递质粒与野生型 AcNPV共转染昆虫细胞，通过同源重组获得重组病毒，再用重组病毒感染昆虫细胞进行外源基因表达 优缺点：表达水平很高，昆虫细胞具有哺乳动物细胞的翻译后加工修饰能力，但不能表达带有完整N-交联的糖蛋白;昆虫细胞表达系统的基本原理及???程;（三）哺乳动物细胞表达载体;2.病毒载体：多根据同源重组原理构建成含外源基因的重组病毒，以感染方式将外源基因导入细胞内，常用的病毒载体有腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、痘病毒等 哺乳动物细胞表达系统的优缺点：表达的重组蛋白能进行正确折叠和糖基化等翻译后加工，在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白；但其整体表达水平偏低，成本较高 ;第二节;一、λ噬菌体载体;（一）插入型噬菌体载体;（二）置换型噬菌体载体 ;（三）噬菌体噬斑形成 ;第三节粘粒和酵母人工染色体;一、粘粒或柯斯质粒;二、YAC载体 ; 蛋白质结构;第一节 氨基酸;一 氨基酸基本结构;二 氨基酸特性与分类;1 极性中性氨基酸;非极性侧链氨基酸（疏水性侧链氨基酸）：侧链均为非极性基团，不能电离，不能与水形成氢键，因此都是疏水性的 ;酸性侧链氨基酸（亲水性侧链氨基酸）：侧链带有-COOH，可电离为-COO-而释放H+ 碱性侧链氨基酸（亲水性侧链氨基酸）：侧链带有-NH2、=NH等碱性基团，可结合H+而形成-NH3+、=NH2+;4 特殊氨基酸;第二节 蛋白质结构;一 蛋白质形态与大小;二 蛋白质一级结构;三 蛋白质二级结构 ;β折叠(β-sheet)也是一种重复性结构，可分为平行式和反平行式两种类型，它们是通过肽链间或肽段间的氢键维系 可以把β折叠想象成由折叠的条状纸片侧向并排而成，每条纸片可看成是一条肽链，称为β折叠股或β股(β-strand)，肽主链沿纸条形成锯齿状，处于最伸展的构象，氢键主要在股间而不是股内 α碳原子位于折叠线上，由于其四面体性质，连续的酰氨平面排列成折叠形式 需要注意的是在折叠片上的侧链都垂直于折叠片的平面，并交替的从平面上下二侧伸出 平行折叠片比反平行折叠片更规则且一般是大结构，而反平行折叠片可以少到仅由两个β股组成 ;β转角(β-turn)是一种简单的非重复性结构 在β-转角中，第一个残基的C=O与第四个残基的N-H合形成一个紧密的环，使β转角成为比较稳定的结构，多处在蛋白质分子的表面 β转角的特定构象在一定程度上取决于其组成氨基酸，某些氨基酸（如脯氨酸和甘氨酸）经常存在其中 脯氨酸具有换装结构和固定的角，因此能在一定程度上迫使β转角形成，促使多肽自身回折，且这些回折有助于反平行β折叠片形成 由于甘氨酸缺少侧链(只有一个H)，在β转角中能很好地调整其他残基的空间阻碍，因此是立体化学上最合适的氨基酸 ;四 蛋白质三级结构 ;许多蛋白质由两个或多个多肽链组成，这种结构称为四级结构（quaternary structure），其中的多肽链称为亚单位