电镜技术及超薄切片技术(研究生)医学.pptVIP

4）块染就是对组织块进行整块染色。一般在脱水前用1%醋酸双氧铀染色，时间为1—2小时。 5）脱水 为了保证包埋介质完全渗入组织内部，必须事先将组织内的水分驱除干净，即用一种和水及包埋剂均能相混溶的液体来取代水，常用的脱水剂是乙醇和丙酮。急骤的脱水会引起细胞的收缩，因此，脱水应梯度进行：70% 丙酮15分钟，80% 丙酮15分钟，90%丙酮15分钟，100%丙酮１0分钟(二次)。 6）浸泡与包埋 浸泡：使某种适宜的液体介质（包埋剂） 渗入组织块取代脱水剂。 包埋：使浸入的介质经高温处理后聚合为坚固体，利于超薄切片。 常用包埋剂：Epon-812环氧树脂、 DDSA、MNA以及加速剂DMP-30等。 （高温处理） 液体————固体 包埋剂的理想性质 理想的包埋剂应具有以下性质： (1)．粘度低，容易渗入组织； (2)．聚合均匀而充分，聚合前后体积变化小； (3)．有良好的切割性能； (4)．能耐受电子束轰击，高温下不变形； (5)．对细胞成分抽提少，微细结构保存良好； (6)．在电镜的高倍放大下，本身不显示任何结构； (7)．材料来源丰富、易得，价格低廉，对人体无害。 透射电镜样品制备操作流程： 取材——漂洗（生理盐水）——前固定（2.5%戊二醛，4oC冰箱2小时以上）——漂洗（0.1M 磷酸缓冲液，3次，45分钟）——后固定(1%锇酸1小时左右）——漂洗（0.1M 磷酸缓冲液，3次，45分钟）——块染（1%醋酸铀2小时）——梯度脱水（50%、70%、80%、90%、100%丙酮各15分钟， 100% 2次，各10分钟）——浸透（丙酮：包埋液=1：1，37 oC烘箱2小时；丙酮：包埋液=1：4， 37oC烘箱过夜；纯包埋液45oC烘箱2小时）——包埋聚合（45oC烘箱3小时，65oC烘箱48小时） 常用包埋剂 1．环氧树脂Epon 812:为进口分装，聚合前后体积变化小(收缩率为2%～5%)，切片在电子束照射下稳定，能较好地保存细胞的微细结构。但操作条件要求较严格，如组织块脱水要彻底，包埋时要注意防潮及防止气泡产生，聚合时温度要控制好等。通常与硬化剂MNA、增塑剂DDSA以及加速剂DMP-30混合使用。 2、环氧树脂Epon 618：国产，效果不如前者。 超薄切片 1、切片前的准备：铜网清洗，用丙酮和乙 醇浸洗 2、支持膜制备：常用Formvar膜聚乙烯醇缩 甲醛），由氯仿配置，浓度为0.5%。 3、玻璃刀制备：专用制刀机制作。 4、半薄切片光镜定位。 5、修块技术。 6、超薄切片厚度在 50—80 nm 之间较为合 适，干涉色为金黄色为宜。 7、捞片：常用粘捞法和圈捞法。 超薄切片机 分两类： 一类是机械推进式切片机，用微动螺旋和微动杠杆来提供微小推进； 另一类是热胀冷缩式切片机，利用金属杆热胀或冷缩时产生的微小长度变化来提供推进。 切片染色： 生物材料是由氢、碳、氮、氧、磷等具有很小原子序数的物质组成，这些物质对电子透射能力和散射能力基本一样，这样所产生图象的反差是很弱的。 采用重金属处理以增强反差、提高分辩率。由于被染色标本的不同结构成份对重金属的结合量不同，染色处理后重金属密度高的部分因散射掉的电子较多，在荧光屏上观察颜色也就较深，这样可获得反差对比良好的图象。 常用的重金属为铅和铀。 电镜观察、拍片、记录等。 首先，观察人员要熟悉电镜的基本操作程序以及所要观察材料的相关知识。 其次，做好观察记录，选好范围拍片，准确记录底片号码及相应内容。 最后，做好各种资料的整理、备案工作。 扫描电镜样品制备流程：取材（做好样品观察面的标志）——漂洗（生理盐水或缓冲液）——固定（2.5%戊二醛2小时以上）——漂洗（0.1M磷酸缓冲液，3次，45分钟）——后固定（1%锇酸，2小时）——脱水（ 50%、70%、80%、90%、95%各15分