核酸降解和核苷酸代谢.ppt

关于核酸降解和核苷酸代谢 第一页，共三十二页，2022年，8月28日 核酸水解 糖苷键、磷酸酯键均可酸水解 最不稳定为嘌啉与脱氧核糖间的糖苷键 酸水解 RNA的磷酸酯键易碱解，DNA耐受 碱浓度0.3-1M,37℃18－24h完成 碱水解 第二页，共三十二页，2022年，8月28日 外源核酸在小肠发生有限的消化吸收 核酸在核酸酶的作用下，水解为寡核苷酸或单核苷酸 单核苷酸可进一步降解为碱基、戊糖和磷酸。 核酸酶解 第三页，共三十二页，2022年，8月28日 根据核酸酶作用的位置不同，又可将核酸酶分为核酸外切酶（exonuclease）和核酸内切酶（endonuclease）。 有些核酸酶能从DNA或RNA链的一端逐个水解下单核苷酸，所以称为核酸外切酶。 核酸内切酶催化水解多核苷酸内部的磷酸二酯键。 核酸外切酶和核酸内切酶 第四页，共三十二页，2022年，8月28日 限制性内切酶 20世纪70年代，在细菌中陆续发现了一类核酸内切酶，能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并在识别序列内或附近特异切割双链DNA的核酸内切酶。称为限制性核酸内切酶（restriction endonuclease） 第五页，共三十二页，2022年，8月28日 限制性内切酶的发现 1953年，Arber研究噬菌体与细菌的关系，发现限制现象。 1962年，Arber发现大肠杆菌对外来侵入的DNA有限制作用。预言了DNA限制性内切酶的存在。 1968年，H·O·Smith分离出第一个内切酶。 1971年，D·Nathans应用内切酶切割SV-40病毒的DNA，获得了第一个DNA的内切图谱 限制性内切酶的发现启动了基因工程时代 三人共享了1978年的诺贝尔奖 第六页，共三十二页，2022年，8月28日 限制与修饰现象 限制酶天然存在于细菌体内，与相伴存在的甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰系统。 修饰和限制现象是50年代初发现的一种细菌自卫的方式。 细菌内两种不同功能的酶：限制性内切酶；甲基化酶。 甲基化酶能识别限制性内切酶所识别的碱基顺序，并把其中某些碱基甲基化。 被修饰酶甲基化了的DNA就不能被限制性内切酶降解 第七页，共三十二页，2022年，8月28日 三类限制与修饰酶 类型Ⅰ：多亚基双功能酶，甲基化和切割由同一酶完成。识别位点和切割位点不一致，没有固定切割位点 类型Ⅱ：修饰和限制由两个分开的酶完成。能识别双链DNA的特殊序列，并可特异切割DNA 类型Ⅲ：双亚基双功能酶，切割位点在识别位点下游24-26bp处。 第八页，共三十二页，2022年，8月28日 限制性内切酶的命名 HindⅢ前三个字母来自于菌种名称H. influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。 EcoRI—Escherichia coli RI HindⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ SacI (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ) 限制酶由三部分构成，即菌种名（斜写）、菌系编号、分离顺序。 第九页，共三十二页，2022年，8月28日 限制性内切酶的特点 识别长度为4-8个核苷酸的特异序列； 许多识别序列具回文结构，如Hind Ⅲ 的识别序列： 5` AAGCTT 3` 3` TTCGAA 5 切割产生的末端有粘端 (cohesive/sticky end) 如BamH I (G↓GATCC) 和平端 (blunt end) 如Sma I (CCC ↓GGG) 第十页，共三十二页，2022年，8月28日 同裂酶与同尾酶 来源不同但能识别和切割同一位点的酶称为同功异源酶 (isoschizomer), 有时也称同裂酶； 有些限制酶识别序列不同，但是产生相同的粘性末端，这些酶称为同尾酶（isocaudamer) 第十一页，共三十二页，2022年，8月28日 基因工程常用工具酶 酶 主要用途 限制性核酸内切酶 识别DNA特定序列，切割DNA分子 DNA连接酶 连接两个DNA分子或片段 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 或Klenow酶 制作DNA探针；合成cDNA第二链； 填补双链DNA 3`凹端； DNA测序。 Taq DNA 聚合酶 聚合酶链式反应（PCR） 多核苷酸激酶 多核苷酸5`-OH磷酸化，制末端标记探针 末端转移酶 使3`-末端加同聚物尾 S1核酸酶 降解单链DNA或RNA DNA酶Ⅰ 在双链DNA上产生随机切口 RNA酶A 降解RNA 逆转录酶 补平反应，合成cDNA或制探针 碱性磷酸酶 切除核酸末端磷酸基 第十二页，共三十二页，2022年，8月28日 核苷酸的进一步水解 核苷酸 H2O Pi 5-Pi-戊糖+碱基 核苷+ Pi