炎症细胞因子在嵌合抗原受体-T细胞治疗中的监测价值.docx

炎症细胞因子在嵌合抗原受体-T细胞治疗中的监测价值 嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）-T细胞免疫治疗通过修饰T细胞技术将识别肿瘤相关抗原的抗体与T细胞的激活结构域结合，从而达到特异性识别和杀伤肿瘤细胞的能力［1］。 近年来，CAR-T细胞免疫治疗技术在国内外广泛应用于多种类型的恶性肿瘤，尤其在淋巴瘤、多发性骨髓瘤以及急性白血病等恶性血液病中表现出很高的缓解率和疗效［2］，但治疗过程中多伴随严重毒性反应，包括细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome，CRS）、神经系统毒性、感染等，其中CRS是最常见也是最严重的不良反应之一［3］。CRS临床表现为全身症状，如发热、低血压、低氧血症，严重的患者可出现凝血功能障碍以及噬血细胞性淋巴组织细胞增生症/巨噬细胞活化综合征等并发症［4］。 为阐明不同炎症因子在CAR-T细胞免疫治疗中的表达特点，本研究在患者接受CAR-T细胞回输后的不同时间点，通过流式微球技术（cytometric bead array，CBA）［5］检测12种炎症因子表达水平，探索这些因子与CRS分级之间的相关性，以期在临床诊疗过程中对CRS的早期诊断和治疗中提供重要依据。 对象与方法 一、对象 2017年11月至2020年12月南京医科大学第一附属医院（江苏省人民医院）采用CAR-T细胞免疫治疗的住院患者12例，包括男性6例，女性6例，年龄53.0（49.8，62.5）岁。多发性骨髓瘤8例，成熟淋巴细胞增殖性疾病3例，急性B淋巴细胞白血病1例。多发性骨髓瘤采用靶向B细胞成熟抗原的CAR-T细胞免疫治疗，B细胞慢性淋巴增殖性疾病和急性B淋巴细胞白血病采用CD19-CAR-T细胞免疫治疗。所有患者在CAR-T细胞回输后30 d内采用CBA监测12种炎症细胞因子以及经典炎症相关指标C反应蛋白（C-reactionprotein，CRP）、D二聚体（D-Dimer，D-D）、血清铁蛋白（serum ferritsn，SF）和乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）水平。根据修订的CRS分级系统［3］，共分成4个级别：0（未出现CRS）、1、2和3级。 二、炎症细胞因子检测仪器及试剂 流式细胞仪器机型为Beckman DxFLEX（美国Beckman公司），12种炎症细胞因子包括白细胞介素（interleukin，IL）-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12P70、IL-17A、干扰素（interferon-α，IFN）-α、IFN-γ和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），试剂来源于江西赛基生物技术有限公司提供。参考区间（pg/ml）为IL-2∶0~5.71，IL-4∶0~3.00，IL-6∶0~5.30，IL-10∶0~4.91，TNF-α：0~4.60，IFN-γ：0~7.42，IL-17A：0~20.60，IL-1β：0~12.40，IL-5∶0~3.10，IL-12P70∶0~3.40，IFN-α：0~8.50，IL-8∶0~53.09，由试剂公司提供。 三、流式细胞术检测 乙二胺四乙酸抗凝静脉血2 ml，1 610×g离心20 min后，取血浆0.5 ml。标准品管中加入25 μl梯度稀释好的标准品，样本管每管加入25 μl的待测样本。将捕获微球混合液用低速离心机200 ×g离心5 min，去上清，加入与上清等体积的微球缓冲液，涡旋混匀，避光孵育15 min后，加入25 μl的荧光检测试剂，室温避光2.5 h后洗涤，每管加入100 μl磷酸缓冲盐溶液上机检测。以前向散射光为横坐标、侧向散射光为纵坐标设门找出与捕获微球结合的炎症细胞因子，见图1A，每管获取目的细胞3 600个，通过APC-A750和APC检测不同细胞因子的表达（图1），用FCAP Array v3软件分析表达水平。 图1?12种炎症细胞因子检测流式细胞术分析示意图［图1A为前向散射光/侧向散射光双参数图设门（P1）圈出微球，图1B为APC/APCA750双参数分析12种炎症细胞因子表达平均荧光强度］ 四、统计学分析 实验数据用 SPSS 25.0和WPS OFFICE软件进行统计学分析。计数资料以例数/CRS各分级例数表示，组间比较采用χ2检验。非正态分布计量资料多组间比较采用Kruskal Wallis秩和检验。采用Spearman相关系数对炎症细胞因子表达水平和CRS分级（有序变量、不符合正态分布的连续变量）进行相关性分析。绘制受试者工作特征（receiver operating characterist，ROC）曲线，确定炎症细胞因子预测CRS的敏感度、特异度。以P0.05为差异有统计