鼠疫检测新技术新方法.ppt

关于鼠疫检测新技术新方法 第一页，共三十八页，2022年，8月28日 一、核酸检测技术 （PCR检测） 二、标记检测技术 （ELISA，胶体金） 第二页，共三十八页，2022年，8月28日 一、核酸检测技术 定义：对动植物、微生物的基因序列进行测定。 核酸的分离与纯化 内容： 聚合酶链式反应(PCR技术) 核酸杂交技术 第三页，共三十八页，2022年，8月28日 核酸的纯化与分离 目的：获得完整的核酸一级结构，并提高核酸纯度。 破碎细胞（细菌） 技术流程 核酸提取 核酸纯化 第四页，共三十八页，2022年，8月28日 材料的前处理 细胞破碎，核酸释放 核酸分离、纯化 沉淀或吸附核酸，去除杂质 核酸溶解缓冲液 第五页，共三十八页，2022年，8月28日 全自动核酸、蛋白提取仪 第六页，共三十八页，2022年，8月28日 聚合酶链式反应（PCR技术） 简史： 1971年，Khorana提出：DNA变性后，与合适引物进行杂交，在DNA聚合酶作用下，延伸引物，并不断重复该过程，即可克隆tRNA基因。 1985年，Mullis等人 发明聚合酶链反应（PCR）， 随后，Mullis所属公司PE推 出第一台PCR自动化热循环仪。 第七页，共三十八页，2022年，8月28日 基本原理： 第八页，共三十八页，2022年，8月28日 基本步骤 第九页，共三十八页，2022年，8月28日 第十页，共三十八页，2022年，8月28日 实时定量PCR仪 PCR仪 第十一页，共三十八页，2022年，8月28日 凝胶成像系统 凝胶电泳系统 第十二页，共三十八页，2022年，8月28日 PCR结果判定（凝胶电泳） 第十三页，共三十八页，2022年，8月28日 PCR类型： 1.多重PCR 2.巢式PCR 3.定量PCR 4.反向PCR 5.逆转录PCR 第十四页，共三十八页，2022年，8月28日 PCR技术在鼠疫检测中的应用 鼠疫菌PCR检测法： 从疑似鼠疫的标本（全血、组织）中检测鼠疫菌，以鼠疫菌fra和pla基因片段作为PCR扩增目的片段。 鼠疫判定标准： PCR扩增（fra + pla） + 胶体金抗原检测 or 酶联免疫吸附试验 or反相血凝试验 = 确诊鼠疫 第十五页，共三十八页，2022年，8月28日 鼠疫菌核酸检测样本处理 样本类别 1.鼠疫菌培养物 2.鼠疫病人血液、痰液或尸检标本 3.自毙或捕获动物血液或组织脏器（肝脏、脾脏等） 4.媒介昆虫 第十六页，共三十八页，2022年，8月28日 样品处理方法 1.煮沸法 2.DNA提取试剂盒 3.CTAB法 4.氯仿抽提法 第十七页，共三十八页，2022年，8月28日 第十八页，共三十八页，2022年，8月28日 鼠疫菌PCR检测 反应体系 10 x buffer dNTPs Fra-F（5’-GGAACCACTAGCACATCTGTT-3’） Fra-R（5’-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3’） Pla-F （5’-ACTACGACTGGATGAATGAAAATC-3’） Pla-R （5’-GTGACATAATATCCAGCGTTAATT-3’） Taq聚合酶 待检测模板（基因组DNA） 去离子水 第十九页，共三十八页，2022年，8月28日 鼠疫菌PCR检测 反应程序 预变性95℃ 5min 1个循环 变性95℃ 1min 退火72℃ 1min 延伸72℃ 1min 变性72℃ 5min 30个循环 第二十页，共三十八页，2022年，8月28日 M 1 2 3 4 5 6 内参基因 Pla Fra 鼠疫PCR检测电泳结果判定 阳性结果：内参基因+Pla+Fra 阴性结果：内参基因 第二十一页，共三十八页，2022年，8月28日 核酸杂交技术 待检测DNA或RNA先转移并固定到硝酸纤维素或尼龙膜上，与其互补的单链DNA或RNA探针用放射性或非放射性标记。在膜上杂交时，探针通过氢键与其互补的靶序列结合，洗去未结合的游离探针后，经放射自显影或显色反应检测特异结合的探针。 第二十二页，共三十八页，2022年，8月28日 二、标记检测技术 标记技术：用标记物质荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。通过测