荧光原位杂交更新.pptx

会计学1 荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization ，FISH） 利用荧光物质标记探针（直接或间接），再进行杂交，可通过荧光显微镜对靶序列进行定性、定位和定量分析FISH技术的应用已经证实或发现了用经典细胞遗传学方法无法证实或发现的肿瘤染色体改变，成为衔接细胞遗传学和分子遗传学之间的一座桥梁。开创了一个新的学科——分子细胞遗传学。第1页/共20页 杂交流程a.两要素： 探针和靶序列b.标记探针 直接标记和间接标记c.变性 探针和靶序列成为单链d.混合杂交e.间接标记的探针需连接荧光基团的步骤第2页/共20页 荧光标记的DNA探针 （200-500bp）F I S H第3页/共20页 荧光原位杂交特点与其它原位杂交技术相比，FISH的优点： ①经济安全，快速方便； ②敏感性高，特异性强，背景低； ③宜于多靶杂交，对同一标本同时进行多个探针杂交，不同的探针可以显示不同的荧光颜色； ④使用G带玻片可作出回顾性分析；缺点： 不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。第4页/共20页 基因特异探针靶向每条染色体只有一个拷贝的DNA序列。主要用于间期或中期染色体中识别染色体易位、倒位、重复和缺失、邻近基因综合征、标记染色体和染色体扩增等，可检测基因的扩增和重排。常用探针类型 — 基因特异探针第5页/共20页 常用探针类型 — 重复序列探针重复序列探针的结合位点是基因组中多拷贝的短重复碱基对序列（例如着丝粒和端粒探针）所在的染色体区域。着丝粒常常是A-T丰富区，而端粒已知含有TTAGGG序列。由于重复序列相对容易制备和分辨率较高（0.5Mb），这种FISH被普遍用于筛查一般的染色体非整倍体、亚端粒缺失和标记染色体。 第6页/共20页 21三体FISH第7页/共20页 常用探针类型 — WCP探针全基因组绘画（WCP）探针是一种复合DNA探针。除着丝粒和端粒区外，全基因组绘画探针对全长染色体有高度亲和力。这些探针最适用于识别中期染色体的基因组不平衡，尤其是在许多癌症中观察到的复杂染色体重排。M-FISH用特殊选择的窄带滤色片连续捕获5种荧光色素中的每一种荧光色素图像；SKY用于荧光色素组合分析的成像设备不同：冷电荷耦合器(CCD)照相机和Fourier变换光谱法相结合，同步曝光成像。这些技术目前在国内一些重点细胞遗传学实验室中开展。第8页/共20页 WCP探针（SKY）第9页/共20页  技术结合—产前BoBSBACs是人类DNA的长片段克隆序列，典型的150-170kbp，相对于短的DNA探针具有更好的信噪比、不受DNA质量影响、更高的覆盖率。将BAC DNA探针耦联至Luminex xMAP荧光编码的微球上，将FISH技术与Luminex技术平台结合，BACs-on-Beads技术可以在同一个微孔内实现多个FISH探针的检测，相对于同时进行成百上千次FISH实验。高通量、标本来源广、快速、结果明确；除了检测13，18，21，X，Y染色体拷贝数目的变化外，还可检测9种常见的微缺失综合征。第10页/共20页  技术结合 — FQ-PCR来自于分子生物学技术-定量荧光聚合酶链反应?和FISH的结合；对染色体13、18、21、X和Y采用荧光引物对染色体特异性高度多态性DNA短重复序列进行PCR扩增，快速诊断非整倍体；特定的基因引物可以检测基因的缺失与扩增检测“有”或“无”和数目异常；位置异常无法判断，如平衡性染色体重排。第11页/共20页 技术13, 18, 21三体微缺失解释容易成本平台费用产前 BoBs++++++++核型分析++---++FISH++--+QF-PCR++--+++-- 几种技术平台比较第12页/共20页 细胞遗传学技术的比较第13页/共20页 FISH相关项目羊水细胞荧光原位杂交分析（包括未培养和培养）血细胞荧光原位杂交分析其他各类细胞荧光原位杂交分析SRY等单基因分析胚胎染色体病诊断（PGD）第14页/共20页 结合技术相关检测项目染色体病快速产前诊断（FISH、qPCR、BoBs）产前单基因病诊断SNP Array 检测某些代谢病的产前诊断第15页/共20页 项目意义1.快速且准确进行检测 较羊水染色体分析，FISH技术可以确定13、18、21、X、Y的染色体数目信息，缓解唐筛阳性患者或高龄孕妇精神负担；缓解医生核型分析工作压力，能够有针对性的对