荧光光分析法测定维生素B全.pptx

会计学;一 、概 述 什么是荧光呢？当某些物质被光照射后， 它会吸收一定频率的光，而发射出波长更长的 光，当光停止时，发射光也随即消失，这就是 荧光现象，它发出的光就叫荧光。第一次发现 荧光现象的是16世纪西班牙的内科医生和植物 学家莫纳德斯 （）, 在一种木头 切片的水溶液中，看到了极为可爱的天蓝色， 以此开始了荧光研究。; 直到1852年在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍长些，才判明这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不是由光的漫射作用所引起的，才确立了荧光是光发射的概念。到19世纪末人们已经知道了包括荧光素、曙红、多环芳烃等600种以上的荧光物质。 ; 20世纪以来，荧光现象被研究得更多了，发现了共振荧光、增感荧光，能够进行荧光产率得绝对测定，还进行了荧光寿命的直接测定等等。 ;二、荧光发生机理;1. 激 发 通常在室温下物质分子 大部分处于基态的最低振动 能级（ ? =0）。当电子吸 收一定频率的电磁辐射发生 能级跃迁时，可上升至不同 激发态的各振动能级，其中 大部分分子上升至第一激发 单重态（ S1 ），这一过程 称为激发。;2.去活化过程 处于激发态的分子是不稳定，它可以通过 不同的途径回到基态，这一过程称为去活化。 去活化过程有以下几种： （1）振动驰豫 溶液中分子间碰撞机会很 多，通过碰撞溶质分子将过剩的能量转移给溶 剂分子，通过非辐射跃迁而降至同一能态的最 低振动能级，这一过程称为振动驰豫。 ; （2）内部转换 同一多重态的不同电子能级间可能发生内部转换。 S2 S1或T2 T1 条件：当S2较低振动能级与S1较高振动能级的能量相当，且发生重叠时分子才有可能S2 S1或T2 T1; （3）荧光发射 处于第一激发的 最低振动能级的分 子，跃迁回基态的 各振动能级，这一 过程称为荧光发射。; （4）体系间跨越跃迁 分子从激发单重态转至能量较低的激发三重态的过程，称体系间跨越跃迁。 三重态：电子自旋方向相同 单重态: 电子自旋方向相反 这些分子从第一激发三重态的最低振动能级下降至第一基态的各振动能级，所发出的辐射即为磷光。;第10页/共54页;1.激发光谱和发射光谱 任何荧光化合物都有两个特征性光谱：激 发光谱和发射光谱 （1）激发光谱 绘制激发光谱时，固定荧光的最大发射波 长，然后改变激发光的波长，所测得的荧光强 度与激发波长的谱线关系即为激发光谱。; （2）发射光谱 发射光谱简称荧光光谱。绘制发射光谱 时，固定荧光的最大激发波长，然后改变发射 光的波长，所测得的荧光强度与发射波长的谱 线关系即为发射光谱。;2.荧光光谱形状与激发波长无关 由于分子无论被激发到高于S1哪一个激发 态，都经过无辐射的振动驰豫或内部转换等过 程，最终回到S1态的最低振动能级，然后跃迁 回基态产生荧光。;3.吸收光谱和荧光光谱有很好的镜像关系 由于分子的S0态和S1态中各振动能级的能量分 布情况相似决定的。因此吸收光谱和发射光谱的形 状相似。;四、荧光与分子结构的关系; ;五、影响荧光强度的因素;F;3.温度的影响 温度对荧光强度的影响较敏感。溶液温度 下降时，介质的粘度增大，荧光物质与分子的 碰撞也随之减少，去活化过程也减少，则荧光 强度增加。相反，随着温度上升，荧光物质与 分子的碰撞频率增加，使去活化几率增加，则 荧光强度下降。; 带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化 合物的荧光一般都与溶液PH值有关，例如：在 pH=7~12的溶液中苯胺以分子形式存在，会发出 蓝色荧光；而在pH2或pH13的溶液中苯胺以离 子形式存在，都不会发出荧光。同时所用酸的种 类也影响荧光的强度，例如：奎宁在硫酸溶液中 的荧光比在盐酸中的要强。 ; 许多有机物及金属的有机络合物，在乙醇 溶液中的荧光比在水溶液中强。乙醇、甘油、 丙酮、氯仿及苯都是常用的有机溶剂，其中大 多有荧光，应设法避免；一般避免的办法是稀 释，或加入一部分水。 ; 6.荧光强度达到最高点所需要的时间不同，有 的反应加入试剂后荧光强度立即达到最高峰。有 的反应需要经过15~30分钟才能达到最高峰。 ; 包括有光源、单色器、样品池、检测器和记录显示装置五个部分。;?? 激发光源应具有足够的强度、适用波长范围 宽、稳定等特点。常用的光源有高压汞灯和氙弧 灯。 氙弧灯又称氙灯，是目前荧光分光分度计中