荧光标记蛋白的发展.pptx

会计学1 Thursday, January 19, 2023荧光标记蛋白在生物研究反面的作用：荧光标记蛋白的基因可作为报告基因，提供细胞内物质的跟踪定位 如图所示为肽链的形成过程肽链经过弯曲、折叠、多条肽链的重叠等形成蛋白质。所以，如若一开始便把荧光标记蛋白的基因插入到某一特定基因内，则新的基因会合成荧光融合蛋白第1页/共12页 Thursday, January 19, 2023如左图所示，当体内物质融合了荧光蛋白后会发出荧光，用显微镜、荧光计、荧光激活细胞分选仪等就可以看见，若在靠近体表处且光源强烈则肉眼可视。例如，要研究细胞内某蛋白质的游走状态，则用荧光蛋白标记后，其所处位置清晰可见。第2页/共12页 Thursday, January 19, 2023 ①最早为水母体中提取的GFP②在适当刺激下会改变结构从而发出或改变荧光的第二类荧光蛋白FHP及其典例GPAC ③必威体育精装版的PRIME技术技术变革第3页/共12页 Thursday, January 19, 2023GFP1，GFP的发现GFP是从一种生活在北太平洋寒冷水域的水母体内发现的。这种水母体内含有一种生物发光蛋白质——aequorin，它本身发蓝光。GFP能把这种光转变成绿色，也就是当水母容光焕发的时候我们实际看到的颜色。受到Ca2+或紫外线激活时, 水母中的发光蛋白Aequorin 被激活, 产生蓝光, GFP 能够吸收蓝光( 395nm 处有最大光吸收) , 发射绿色( 或黄绿色) 荧光 第4页/共12页 Thursday, January 19, 20232，GFP发光原理GFP控制光的部位是其自身的一部分，仅由氨基酸构建而成，该部位含有一段三个氨基酸组成的特殊序列：丝氨酸－酪氨酸－甘氨酸（有时丝氨酸会被相似的苏氨酸取代）。当蛋白质链折叠时，这段短片段就被深埋在蛋白质内部，然后，发生一系列化学反应：甘氨酸与丝氨酸之间形成化学键，生成一个新的闭合环，随后这个环会自动脱水。最终，经过大约一个小时的反应，周围环境中的的氧气攻击酪氨酸的一个化学键，形成一个新的双键并合成荧光发色团。蛋白质链形成一个圆柱形罐头（蓝色），子链的一部分直接从中间穿过（绿色），发色团刚好在罐头盒的中间，它被保护起来以免受周围环境的影响。这种保护对于发射荧光是必需的。 第5页/共12页 Thursday, January 19, 20233，与其他报告基因不同的性质①从生化角度来讲, 所有已知的荧光素酶都是氧化酶, 它利用分子氧来氧化底物, 使产物分子处于一种激发态而发光。这种酶/底物的相互作用是生物发光的普遍模式。而GFP 是第一个例外, 它的27kDa 的单体由238 个氨基酸构成, 本身就是一个生物发光系统。其荧光机制是自身含有的, 绿色荧光的发射仅需分子氧的存在, 而无需其他外源辅因子②GFP 的表达无种属特异性。不管细胞的种类和位置如何, 都能够自主表达; ③GFP 还能克服穿透、毒素、光漂白等不利因素[1]。GFP 的荧光可以耐受福尔马林的固定, 因而可以制成长期保存的标本; ④对细胞内GFP 的检测非常简单, 用显微镜、荧光计、荧光激活细胞分选仪等就可实现4，GFP目前存在的不足( 1) 检测灵敏度还有待提高, 而且其荧光信号强度方面的非线性性质使得定量非常困难。( 2) 新生GFP 折叠和加工成为具有荧光活性形式的过程十分缓慢, 使得某些快速过程如转录的激活过程还难以用该方法进行研究。( 3) 紫外激发对某些GFP 有光漂白和光破坏作用, 导致荧光信号快速丧失。( 4) 多数生物具有微弱的自发荧光现象, 并有着类似的激发和发射波长, 这些荧光背景会影响某些GFP 的检测。 第6页/共12页 Thursday, January 19, 2023FHP（fluorescent highlighter proteins光激活蛋白即第二类荧光蛋白）及GPAC （Green ＿photoactivatable ＿ Cherry光激活绿樱桃） 1，第二类荧光蛋白，FHP①特点这些荧光蛋白在适当的刺激下会经历结构的改变，从而打开荧光这个开关，或者荧光发射波长改变。与第一代荧光蛋白相比，它们的优势在于能脉冲标记细胞或分子亚群，从而实现复杂的动力学时空分析②典例：PAGFP，mRFP1，KFP1，Dronpa等③缺点：其中一些蛋白光转换效率不高，亮度较低，会迅速淬灭，或者需要多聚化。此外，光转换通常伴随着第一种颜色的丧失，这样不得不借助计算机方法来查看整个群体。第7页/共12页 Thursday, January 19, 20232,GPAC构成：这是一个融合蛋白，它融合了红色荧光蛋白（RFP）单体Cherry和GFP的光激活变异体。这种融合蛋白能够在表达标志物的细胞中持续发出红