荧光定量PCR检测项目.pptx

会计学1 实时荧光定量PCR 方法 ------TaqMan法　　方法： TaqMan法TaqMan---水解型杂交探针与目标序列互补5′端标记有荧光报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针第1页/共28页 5’3’5’5’3’5’ForwardPrimerReversePrimerTaqMan? ProbeRQTaqman实时PCR的反应过程第2页/共28页 Displacement5’3’5’5’3’5’ForwardPrimerReversePrimerRQ第3页/共28页 Hydrolysis5’3’5’5’3’5’QR第4页/共28页 Polymerization Completed5’3’5’5’3’5’RQ每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光第5页/共28页 实时荧光定量PCR定义　在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法第6页/共28页 实时荧光定量PCR 原理　　　　　实时原理 常 规 PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析第7页/共28页 实时荧光定量PCR原理　　　　　　定量原理如何对起始模板定量？　　　通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析介绍三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值第8页/共28页 扩增曲线扩增曲线图： 横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光检测元件第9页/共28页 荧光阈值荧光信号阈值 （threshold ）： 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值 荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于 真正的信号:荧光信号超过域值第10页/共28页 Ct值Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数C(t) value 第11页/共28页 Ct值的重现性横轴：PCR反映循环数纵轴：荧光信号量Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性第12页/共28页 定量原理理想的PCR反应： X=X0*2n非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率第13页/共28页 定量原理在扩增产物达到阈值线时: XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1) XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得: log M=log X0 (1+Ex)Ct (2)整理方程式(2)得: log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log M (3) Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量第14页/共28页 标准曲线 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小 Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量第15页/共28页 确定未知样品的 C(t)值 通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量Sample绝对定量25第16页/共28页 标本采集和运送血液标本：用2ml真空采集管或高压灭菌离心管采集血液标本，血标本采集后在2小时内送达实验室（HCV采用EDTA抗凝的血浆）。离心（检验单与标本一道）后用一次性吸管吸取血清或血浆加入经消毒的的离心管中。脑脊液：由临床医生采集后放入消毒的试管中及时送检。用于临床标本采集的容器如试管或离心管，均应使用前高压灭菌和密封 标本