人粪便中华支睾吸虫虫卵检测 PCR和实时荧光PCR法.pdfVIP

人粪便中华支睾吸虫虫卵检测 PCR 和实时荧光PCR 法 1 范围 本文件规定了人粪便中华支睾吸虫虫卵PCR和实时荧光PCR法的试剂、材料和引物，仪器和设备，样 品采集，核酸提取，DNA 的浓度和纯度测定，检测方法和结果判定。 本文件适用于人粪便中华支睾吸虫虫卵核酸检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp：碱基对（base pair） CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammonium bromide） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid） dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate） EDTA：乙二胺四乙酸（ethylene diaminetetraacetic acid） FAM：6-羧基荧光素 (6-carboxyfluorescein) OD：光密度值（optical density） PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） Taq 酶：DNA 聚合酶（thermus aquaticu） TE 缓冲液：Tris-HCl、EDTA 缓冲液（Tris-EDTA buffer solution） Tris：三(羟甲基) 氨基甲烷[tris (hydroxymethyl) aminomethane] MGB：小沟结合物（minor groove binder） 5 试剂、材料和引物 试剂 5.1.1 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。试验用水应符合 GB/T 6682 中一级水的规定。 5.1.2 液氮。 5.1.3 EDTA 缓冲液 （0.5 mol/L、pH 8.0）。 5.1.4 CTAB 提取缓冲液 （2.0%）。 5.1.5 CTAB 沉淀液 （0.5%）。 5.1.6 蛋白酶 K 溶液 （20 mg/mL）。 5.1.7 NaCl 溶液（1.2 mol/L）。 5.1.8 三氯甲烷。 5.1.9 三氯甲烷/异戊醇（24:1，V/V）。 5.1.10 异丙醇。 5.1.11 70% 乙醇。 5.1.12 TE 缓冲液。 5.1.13 加样缓冲液。 5.1.14 Golden View 核酸染料（或其他等效核酸染料）。 5.1.15 Premix Taq 反应预混液（市售商品化 PCR 基础试剂）。 5.1.16 Premix Ex Taq （Probe qPCR）（2×）反应预混液（市售商品化荧光 PCR 基础试剂）。 5.1.17 琼脂糖凝胶。 5.1.18 1×TAE 电泳缓冲液。 试剂配制 试剂配制参见附录 A。 材料 5.3.1 无 DNA 酶污染的离心管（1.5 mL、2.0 mL）。 5.3.2 PCR 反应管。 5.3.3 无 DNA 酶污染的吸头（10 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL）。 引物 5.4.1 普通 PCR 引物序列见表 1。 表1 普通PCR 引物序列 名称 序列 片段大小 上游引物 5’-TTGTCTGGGTAGGGTGGTTTG-3’ 231 bp 下游引物 5’-ACTATCCCAGTAACCCCGCC-3’ 5.4.2 实时荧光 PCR 引物与探针序列见表 2。 表2 实时荧光 PCR 引物、探针序列 名称 序列