《遗传学实验》课件-实验一肝细胞的原代分离与培养.ppt

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实验安排 考试成绩的组成 实验操作课:出勤30%,操作40%,作业30% 讨论课:出勤40% 表达60% 考试 实验一、肝细胞的原代分离及培养 实验目标 了解掌握组织中细胞分离、培养的方法 掌握台酚蓝染色进行活细胞计数方法 掌握血球计数板使用方法 器具 中号烧杯,平皿,小镊子,大镊子,小剪子,血球计数板,手套,试管架、酒精喷壶 离心管(15/50mL),吸管、100目孔径滤网、1mL 移液器及Tip头、研磨玻片 试剂 胰酶、PBS、台酚兰、75%酒精 操作步骤 1、将小鼠断颈处死,置75%酒精烧杯泡2-3分钟。 断颈法:小鼠处死最常用的方法,也是小鼠痛苦程度最小的处死方法,符合动物福利学。 小鼠抓持方法  注意:小鼠很灵活,头部固定不牢,易被其反咬!! 操作步骤 2、用针头将小鼠四肢固定在泡沫板上,腹部朝上。镊子捏起腹部皮肤,剪刀剪一小口,暴露腹壁。 注意:不要一刀剪破腹壁,这样毛容易进入腹腔,里面就不是无菌的了。 镊子夹起腹壁,剪开腹腔,取出肝脏,置于培养皿中,剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物,转移到另一个盛有PBS液的平皿中。 镊子捏起腹部皮肤,剪刀剪一小口,暴露腹壁。 镊子夹起腹壁,剪开腹腔,取出肝脏, 操作步骤 3、用手术剪将肝脏剪成小块(约1mm3),再用玻片充分研磨,转移到离心管,离心1000 rpm,5min。 注意:玻片研磨既需要充分又不能用力太大 操作步骤 4、视组织或细胞量加入5-6倍(3-5mL)胰酶,37℃水浴中消化20分钟,每隔5分钟振荡一次,或用吸管轻柔吹打一次,使细胞分离。 操作步骤 5、加PBS至50 mL,用100目孔径滤网滤过,除去未消化的大组织块。 注意:这个过程易损失细胞,将粘滞在筛子 上的细胞尽量用PBS冲洗干净。 操作步骤 6、将通过滤网的细胞置于15mL离心管中,1000rpm,离心5分钟,慢慢弃去上清液。 注意:将离心管从离心机取出时,动作要轻 柔,否则细胞很容易被重新悬起。 不要多次倾倒离心管,只倾倒一次。 操作步骤 7、加入红细胞裂解液(Tris-NH4Cl)5mL,冲散细胞,约2min,裂解红细胞。 操作步骤 7、加入PBS 5mL,冲散细胞,再离心一次,弃上清液。 操作步骤 8、加入含血清的培养液1-2 mL(视细胞量而定,在此可用PBS代替),用于计数。 操作步骤 9、细胞计数前,先用台酚蓝染料染色,细胞悬液与0.4%台酚蓝溶液以9:1混合均匀,用血球计数板计数,计数活细胞。 台酚蓝(Trypan Blue) :是细胞活性染料,常用于检测细胞膜的完整性。还常用于检测细胞是否存活。活细胞不会被染成蓝色,而死细胞会被染成淡蓝色。 血球计数板构造 每个大方格 面积:1.0 毫米 × 1.0 毫米=1.0 平方毫米 容积:1.0 平方毫米 × 0.1 毫米= 0.1 立方毫米。

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