《遗传学实验》课件-实验三 考马斯亮蓝.ppt

实验三 考马斯亮蓝染色法显示细胞骨架 实验目的 掌握考马斯亮蓝染色法显示细胞骨架的方法 实验原理 细胞骨架包括：微管、微丝、中间纤维 显示细胞骨架的方法：考马斯亮蓝染色法和免疫荧光染色法 实验原理 考马斯亮蓝染色法：去垢剂Triton X-100处理细胞，可以溶解膜脂，并与大部分非骨架蛋白疏水区结合而将其溶解掉，剩下细胞骨架系统的蛋白不被溶解，然后用蛋白染料考马斯亮蓝染色即可显示细胞骨架。 实验原理 考马斯亮蓝R250(coomassie brilliant blue R250） 该染料每分子含有2个SO3H基团，偏酸性，结合在蛋白质的碱性基团上，且染料的苯环与芳香族氨基酸结合 器具及试剂 材料：贴壁生长的细胞 M缓冲液、磷酸缓冲液、Triton X-100、 戊二醛、考马斯亮蓝染液R250 实验步骤 1、将细胞培养在盖玻片上。取出盖玻片，用PBS洗3次。 注意洗片时，不要对着片上的细胞直接冲洗，以免将细胞冲走。 实验步骤 2、室温下用1% Triton X-100处理20～30min。 Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚)：一种非离子型表面活性剂，它能溶解脂质，以增细胞膜的通透性。 实验步骤 3、用M缓冲液轻轻洗细胞3次 M缓冲液配方： 咪唑 50 mmol/L； KCl 50 mmol/L；MgCl2 0.5 mmol/L；EGTA 1mmol/L；EDTA 0.1 mmol/L；巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）1 mmol/L；用1 mol/L盐酸调pH至7.2 各成分作用是什么？ 实验步骤 4、用3.0 %戊二醛固定细胞10min。 戊二醛（glutaraldehyde），含两个活泼的醛基，是一种双交联剂，两个醛基分别可以通过与相邻的另一氨基反应，产生较强的交联作用。戊二醛对蛋白质的固定效果好，且不破坏细胞骨架的结构。 实验步骤 5、用PBS洗三次，滤纸吸干。 实验步骤 6、用0.2%考马斯亮蓝R250染色30min。蒸馏水冲洗，在空气中自然晾干。