《遗传学实验》课件-实验二、涂片染色法观察骨髓自然凋亡细胞.ppt

Apoptosis源于希波哥拉得词语，意思是秋叶凋落。秋天落叶完全是一种自然现象，对树木来说是预定了得生命环节的一环，实乃为生而死，这就是凋亡所具有的意义。在生物界细胞凋亡的例子很多，如神经元细胞，蝴蝶，蝌蚪。 最早发育生物学家发现动物发育过程中存在细胞程序性死亡现象以后在这种现在的研究中提出细胞凋亡的概念。以前人们将细胞凋亡与PCD视为同一概念，随着研究的深入，我们发现两者确实存在着差别。 实验二、涂片染色法观察骨髓自然凋亡细胞 实验目的 掌握骨髓涂片的制作与染色 掌握油镜的使用方法 了解细胞凋亡的形态学特征 了解凋亡的常用检测方法 细胞凋亡 (apoptosis ) 是在一定的生理或病理条件下，一种由基因调控的细胞主动的死亡过程。 骨髓中造血干细胞发育为血细胞过程中有部分细胞会发生凋亡。 细胞在凋亡过程中会发生一系列变化，如形态变化、DNA有规律地断裂、膜表面物质组成发生变化等。 实验原理 造血干细 胞的分化 凋亡细胞的形态学变化主要体现在细胞核，首先出现染色质凝集于中央异染色质区域或核膜下，形成浓缩的染色质块，嗜碱性染色增强；随着染色质不断凝聚，核膜在核孔处断裂形成碎片，散布于细胞中；最后细胞核裂解为碎块，核碎片和部分细胞质由膜包被形成凋亡小体，从细胞表面出芽脱落。 核的这些变化用普通染核染料或能与DNA结合的荧光染料都可以显示出来。 实验原理 Giemsa染色：一般用于血液和造血组织来源的细胞或白血病细胞的染色。 Giemsa染色液由美蓝，伊红组成。伊红为酸性染料，可以与碱性蛋白质结合，呈粉红色；美蓝为碱性染料，可以与酸性物质，如细胞核蛋白和淋巴细胞胞浆结合，呈紫蓝色；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，呈淡紫色。 实验原理 正常细胞核染成蓝色或蓝紫色，细胞浆染粉红色，色泽均一。凋亡细胞可见核固缩，染色变深，细胞膜皱褶、卷曲、出泡以及出芽形成凋亡小体。 油镜的使用 油镜的放大倍数较高，而透镜很小，光线通过不同密度的介质物体（玻片→空气→透镜）时，部分光线会发生折射而散失，进入镜筒的光线少，视野较暗，物体观察不清。如在透镜与玻片之间滴加和玻璃折射率（n=1.52）相仿的香柏油（n=1.515），则使进入油镜的光线增多，视野亮度增强，物象清晰 。 （1）在使用油镜之前，必须先经低、高倍镜观察，然后将观测目标部分移到视野的中心。 （2）将集光器上升到最高位置，光圈开到最大。 （3）转动物镜转换器，使高倍镜头离开通光孔，在需观察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢转动油镜，在转换油镜时，从侧面水平注视镜头与玻片的距离，使镜头浸入油中而又不以压破载玻片。 （4）用左眼观察目镜，并慢慢转动细调节器至物象清晰为止。如果不出现物象或者目标不理想要重找，在加油区之外重找时应按：低倍→高倍→油镜程序。在加油区内重找应按：低倍→油镜程序，不得经高倍镜，以免油沾污镜头。 （5）油镜使用完毕，先用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头上和标本上的香柏油擦去，然后再用干擦镜纸擦干净。 实验材料及器具 小白鼠 0.9%生理盐水、甲醇、PBS、Giemsa染液 光学显微镜、离心机、剪刀、注射器及针头、离心管、吸管、载波片 实验步骤 1、骨髓细胞的收集：断颈法处死正常小白鼠，去除前、后腿部肌肉，从关节处卸下长骨；减掉长骨两端，用注射器吸取生理盐水将骨髓腔内细胞冲至离心管中；细胞悬液经1000 r/min离心8min，弃去大部分上清液，留少许上清液（约相当于细胞沉淀的体积），用生理盐水重悬细胞。 实验步骤 2、制备细胞悬液涂片：用滴管加1小滴（约10μL）细胞悬液于载玻片长轴一端离边缘约1cm处中央。将有样品的载玻片A放在实验台平坦之处，右手持另一张载玻片B作为推片。先用一侧短边边缘接触细胞前沿，待细胞沿载玻片B边缘展开成线后，使载玻片B以与载玻片A呈30度～45度角向前匀速移动，将细胞推成厚薄适宜的细胞涂片。将推好的细胞涂片在空气中晃动，使其迅速干燥。 实验步骤 3、固定：给载玻片上的细胞标本处滴加甲醇，固定3min，若到时甲醇未干，可用吸水纸吸干。 甲醇具有强大的脱水力，可将细胞固定在一定形态及增加细胞结构的表面积，提高细胞对染料吸收作用，同时由于甲醇吸附染色液中的水，使染色液升温，加速染色反应。 Apoptosis源于希波哥拉得词语，意思是秋叶凋落。秋天落叶完全是一种自然现象，对树木来说是预定了得生命环节的一环，实乃为生而死，这就是凋亡所具有的意义。在生物界细胞凋亡的例子很多，如神经元细胞，蝴蝶，蝌蚪。 最早发育生物学家发现动物发育过程中存在细胞程序性死亡现象以后在这种现在的研究中提出细胞凋亡的概念。以前人们将细胞凋亡与PCD视为同一概念，随着研究的深入，我们发现两者确实存在着差别。