蛋白质的提取.ppt

V=EQ/(6πrη) M=V/E=Q/(6πrη) V：电泳速度 M：迁移率 E：电场强度 Q：颗粒带电荷量 r：球形分子半径 η：介质粘度 第三十一页，共七十二页，2022年，8月28日 【实验原理】 2. 影响电泳的因素： 内在因素：蛋白所带净电荷的量、蛋白的大小和形状 外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象 第三十二页，共七十二页，2022年，8月28日 影响蛋白质分子运动速度的因素 ? 决定 运动方向 电场 作用力 形成 阻力 决定 运动速率 电荷性质 电荷量 分子形状 分子大小 √ √ √ √ √ √ √ 第三十三页，共七十二页，2022年，8月28日 3.醋酸纤维素溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120μm，有很强的通透性，对分子移动阻力很小。该薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点 第三十四页，共七十二页，2022年，8月28日 血清蛋白参考值 等电点 分子量（kDa） 占总蛋白的百分数(%) 清蛋白 4.64 69 61~71 α1球蛋白 5.06 200 3~4 α2球蛋白 5.06 300 6~10 β球蛋白 5.12 90~150 7~11 γ球蛋白 6.85 156~950 9~18 第三十五页，共七十二页，2022年，8月28日 4. 经醋酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白按电泳速度分为5条区带，从正极端依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白，经染色可计算出各蛋白质的百分含量。 第三十六页，共七十二页，2022年，8月28日 【实验器材】 1. DYY-6C型 ?双稳定时电泳仪和DYY-Ⅲ型电泳槽 2.醋酸纤维薄膜（2 cm×8cm）：1片/人。 3.培养皿：一排桌子公用5套，包括平衡、染色各用一套，漂洗用3套。 4.点样器：载玻片。 5.滤纸：公用。 6.镊子：一个/组。 第三十七页，共七十二页，2022年，8月28日 【实验试剂】 1、巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH8.6，0.07 mol/L，离子强度0.06) 2、0.5% 氨基黑10B染色液 3、漂洗液 第三十八页，共七十二页，2022年，8月28日 1.浸泡 将2×8 cm醋酸纤维薄膜置于电泳缓冲液中，浸泡15 min左右，至完全浸透，方可用于点样。 【实验操作】 第三十九页，共七十二页，2022年，8月28日 2.点样 用镊子取出浸透的薄膜，夹在两层粗滤纸内吸干多余的缓冲液，迎光判断光面与无光泽面。用边缘整齐的玻片沾取少量无溶血血清，垂直按压于醋纤膜标号一端约1.5-2㎝处(约2～3μl) 第四十页，共七十二页，2022年，8月28日 3.电 泳 将点样端的薄膜平贴在阴极滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极滤纸桥上(见下图)。要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。 平衡片刻(2-3min)；使其自然充满缓冲液；而后电压120V，电流0.4～0.6mA/㎝，通电45分钟。 第四十一页，共七十二页，2022年，8月28日 4.染色： 电泳完毕后将薄膜取下, 放在含氨基黑10B染色液的培养皿中浸泡3-5 min 第四十二页，共七十二页，2022年，8月28日 5.漂洗： 将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次(3-4次)，直至条带清晰为止，可得到色带清晰的电泳图谱 。 第四十三页，共七十二页，2022年，8月28日 6. 记录和分析实验结果漂洗完毕后将薄膜取出, 放在滤纸上。将薄膜上的5条色带根据其颜色深浅、形状、大小及相对位置进行描述、记录在预习本上，并判断分析其结果。 第四十四页，共七十二页，2022年，8月28日 【注意事项】 1、点样前，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，吸水量以不干不湿为宜。 2、薄膜的浸润与选择正确膜面是电泳成败的关键之一。 3、点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不宜过多或过少。 4. 手尽量不要触及薄膜，用镊子夹取。 5、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜 片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。垂直点样。 6、电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且点样面向下。 7、电泳开始后，不能再取放薄膜，以防触电。如必需进行，要先关闭电源。 8、应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太短，着色不易区分，或造成条带染色不均匀，必要时可进行复染。 第四十五页，共七十二页，2022年，8月28日 【思考题】 电泳图谱清晰的关键是什么？如何正确操