细胞生物学研究方法.ppt

第一节 细胞形态结构的观察方法 第二节 细胞化学技术 第三节 细胞分选和离心分离技术 第四节 细胞生理学技术 第五节 细胞工程技术 第一节 细胞形态结构的观察方法 一、光学显微镜技术 （Light Microscopy） 二、电子显微镜技术 (Electron Microscopy) 三、扫描隧道显微镜 (Scanning tunnel microscopy) 一、光学显微镜技术 (Light Microscopy) ? 普通复式光学显微镜术(Light microscopy) ? 荧光显微镜术 (Fluorescence Microscopy) ? 相差显微镜术 (Phase-contrast microscopy) ? 暗视眼显微镜术 (Dark Field Microscopy) ? 微分干涉显微镜术 (Differential-interference microscopy) ? 视频反差增强显微镜术 (Video-enhance microscopy) ? 激光共焦扫描显微镜术 (Laser Confocal Microscopy) ? 荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transer) ? 荧光漂白恢复技术(Fluorescence recovery after photobleaching) ? 普通复式光学显微镜术 光学显微镜主要包括光学放大系统（目镜和物镜）、照明系统（光源、折光镜和聚光镜）和机械支架系统三部分组成。 光学显微镜用于观察细胞的显微结构。决定光学显微镜性能的主要因素是显微镜的分辨率(D)，分辨率是指区分开两个质点间的最小距离。 D= 0.61 ?/N sin(?/2) 其中：?代表光波波长；N为物镜与标本间的介质折射率，空气的N=1，香柏油的N=1.5； ?为物镜镜口角，小于140度。因此，分辨率D最小为0.2?m。 N sin(?/2)的量称为数值孔径，简写为NA，其数值刻在物镜上。 ? 相差显微镜术（Phase-contrast Microscopy） 1935年，荷兰籍德国人F. Zermike成功设计了相差显微镜。它可将透过标本的可见光的光程差转换成振幅差，表现为明与暗的对比，从而提高了各种结构间的对比度，使得结构变得清晰可见。 在结构上，相差显微镜与普通显微镜的不同点在于：具有环形光阑的聚光镜和带有相板的相差物镜。当光线经过相差聚光镜、样品和相差物镜时，光线分为两部分，一部分为样品结构的折射光，另一部分为不受样品影响的光，经过相板，二者发生互相叠加或抵消的干涉现象，从而表现为肉眼明显可见的明暗区别。 相差、微分干涉、荧光显微镜 相差显微镜图像的反差是以样品中的密度差别为基础形成的，故其观察的样品不需染色，适用于观察较透明的活细胞或染色反差小的细胞组织。 用相差显微镜观察细胞分裂 ?微分干涉显微镜术（Differential Interference Contrast Microscopy） 1952年，Nomarski在相差显微镜原理的基础上发明的。利用平面偏振光的干涉效应而设计的。 相差、微分干涉、荧光显微镜 适于研究活细胞中较大的颗粒或细胞器。影像具有很强的立体感。 ? 荧光显微镜术（Fluorescence Microscopy） ? 暗视眼显微镜术（Dark Field Microscopy） 聚光镜的中央有挡光板，使得照明光不能直接进入物镜，只允许被标本反射和折射的光进入物镜形成亮的像。这样就观察到暗背景中发亮的细胞结构。 可观察4～200 nm的微粒子，分辨率比普通光学显微镜高50倍； 适用于观察活细胞以及细胞内微小颗粒，例如线粒体、细菌运动等。 ? 视频反差增强显微镜术（Video-enhance contrast Microscopy ） 为计算机辅助的微分干涉显微镜，通过电子仪器使摄像机获得的模拟影像，以视频速度进行影像反差增强处理，并以视频速度显示出来。可在高分辨率下研究活细胞中的颗粒及细胞器的运动，如单根微管的动态变化。 用视频反差增强显微镜观察到的细胞中的微管 ? 激光共焦扫描显微镜术（Laser Confocal Microscopy） 以激光作为荧光的激发光，通