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DNA 的限制性内切酶酶切分析 1.酶切: 20ul反应体系 组分 加入体积 灭菌双蒸水 12μl 10×buffer H(含BSA) 2μl 质粒DNA 5μl 4U/ul EcoRI 1μl 掌型离心机混匀，37℃水浴反应30min 操作步骤（改动） EcoR I的作用模式图: 产生5 ?突出粘性末端 **********GAATTC******** **********CTTAAG******** 5? 3? 5? 3? EcoR I ********G ********CTTAA 5? 3? －OH － P －AATTC******* G******* 3? 5? P OH－ 5? 5? EcoR I Bcl-2 (1.9kb) pBS (2.96kb) pBS-Bcl-2 (4.86kb) Bcl-2重组质粒的酶切模式图 4.点样： 4 ul载样buffer+酶切产物，取其中24 ul上样 2 ul载样buffer +10ul 未酶切的质粒 1 ul载样buffer +5ul DNA Marker （点样孔置负极端） 3.倒胶：胶冷却至70℃左右(不烫手背)，加核酸染料5ul ，缓缓倒入电泳槽 (先胶布封口，放好梳子) 2.制胶(0.8%)：称取0.32g琼脂糖倒入三角瓶中，加入1×TAE缓冲液40ml（已完成），微波炉中火加热2分钟至沸腾，摇匀，至无颗粒。 5.电泳：稳压条件下150V电泳，待溴酚蓝移动至接近胶前沿时停止电泳(约15min)。 6.观察结果：紫外分析仪上254nm观察，DNA存在处显亮绿色荧光条带，观察酶切后与未酶切质粒的DNA带位置。 100bp DNA Marker 已酶切质粒 未酶切质粒 3000bp 1500bp 1000bp 500bp 2.96kp 1.9kp 点样孔 注意事项 1. 第一步确保样品加到反应体系中,若有粘壁，用掌型离心机离心到底部! 2. 当样品在37℃ 水浴时，要盖紧盖子，否则水汽进入管内，使反应体积大大增加，造成酶切失败 3. RE一定要在低温(－20℃)下贮存(含50％甘油) ，每次吸取后应放在冰盒，用完后立即放在-20℃，新购的大包装酶应先分装
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