分子生物学在水产品中的应用.docx

分子生物学在水产品中的应用 摘要：对限制性酶切、PCR诊断等方面对分子生物学在疾病诊断上的应用进行了综述， PCR分子生物学技术在水产养殖动物细菌病原检测中的应用进行综述，以及提出水产品的鉴定技术。 关键词：分子生物学技术 ;水产细菌检测；水产品动物疾病监测;分子诊断； 分子生物学技术不仅在水产养殖上可以培育生长快、抗寒、抗病的新品种,而且在水产动物疾病诊断上亦可显示其独有的优势。传统的鱼病诊断主要依据肉眼观察、症状判别、显微境检查、微生物培养、表型分析、血清学分析、病理切片观察等,这些方法的诊断时程较长。而水产动物发病迅速,由于不能及时治疗而给生产造成重大损失。分子生物学技术的诞生,使水产动物疾病快速而直接的分子诊断得以实现。近年来，随着人们生活水平的不断提高，大西洋鲑鱼、鳕鱼等高值水产品的消费量逐年增大。随着水产品贸易量增加，加工方式多样化，水产品及其加工品相关的商业欺诈现象也在增加，采用低值水产品冒充高值水产品的行为时有发生，不仅破坏了水产品贸易的公平性，也损害了消费者的合法权益，甚至带来食品安全问题。故水产品疾病被及时发现与治疗，及水产品的真伪鉴定，对水产品健康发展具有重要的意义。 1. 分子生物学在疾病诊断上的应用 1.1 限制性酶切( Restrictionenzyme digestion) 检测 限制性酶可识别DNA上较短的序列,在识别位点上切开DNA,单个核苷酸变化即可导致限制性酶切位点的增加或缺失。因此,酶切后产生的片段数目发生了改变,即所谓的限制性片段长度多态性( Restrictionfragment length polymor- phisms,RFLP)。然后进行凝胶电泳,酶切后的DNA片段根据大小在凝胶电泳上进行分离,染色后即可观察各个不同的片段,进行遗传变异的分析。不同样品总DNA酶切后即可产生限制性酶切多态性。然而检测这些多态性差异,需要使用标记的特异DNA探针加以确定。同位素标记通过放射自显影显示,非同位素标记(如酶标记等)可通过显色技术显示,从而揭示DNA的多态性。另一种方法可以不需要DNA探针杂交,而首先对DNA片段进行限制性酶切,然后靶定DNA特定片段,通过PCR扩增显示限制性片段多态性,即所谓的扩增片段长度多态性( Amplificationfragment length polymorphisms, AFLP) 。这种诊断对于病原微生物是相当有用而直接的方法。也可以鉴别特定的寄生虫。 Chang等从美国3个不同的海岸水体( NewYork、NewJersey、Texas) 收集的蓝蟹( Callinectessapidus) ,通过PCR和原位杂交，分析两步诊断证实存在白斑综合症病毒( White spot syndrome virus,WSSV)。通过RFLP方法,对于一个1156bp片段的WSSVrrl-specificRsaI进行扩增,从而区别NewJersey蓝蟹WSSV和其他地方分离的WSSV。 1.2聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction,PCR) 检测PCR是用于在体外酶促扩增特定DNA片段的快速方法。PCR反应包括模板DNA(从样品组织中提取纯化的DNA),引物(可以和模板DNA任一端结合的单链寡核苷酸),聚合酶和一定浓度的脱氧核苷三磷酸(dNTP,用来形成新复制子)和合适的无机盐缓冲液。PCR每一热循环包括变性(模板DNA变性)、退火(引物到互补区)、延伸(模板DNA与引物结合后,多聚酶催化相应核苷酸加到每一引物未端进行延伸)。理论上讲,每一循环使PCR产量应呈几何级数增长。这样PCR可以极大提高诊断速度。由于PCR受多因素影响,即使产物中出现了某一DNA,也不足以说明样品被某一特定病原体感染。还需进一步试验(如限制性酶切、探针杂交或核苷酸测序)增加诊断的特异性。实际上,应用过程中往往是多种方法结合使用。Walton等报道了P病毒探针的构建,P病毒基因组杂交探针,可通过PCR大量制备。然后用来进行点印迹或者原位杂交特异地检测自然或实验室感染动物的组织和细胞。这是对于温带蟹地方性病毒构建的第1个基因探针,对于病毒生态、病毒和寄主相互作用研究非常重要。斑节对虾( Penaeus monodon) 用WSSV病毒接种,通过RT-PCR分析,在感染4h后tk-tmk基因的转录可以被检出。基于DNA的分子诊断,结合适宜的扩增(如PCR)技术,在水产动物疾病诊断上得到了广泛的应用。尤其对传染性疾病的发现和认定提供了有力的工具。通过遗传物质特定序列的比较和识别,可以对病原进行调查和跟踪研究。对特定病原控制,可以更方便地为管理部门提供策略。用于诊断目的的PCR反应条件需要优化,影响因子需要考虑。为了获得更大的灵敏度和特异性,引物设