抗原、抗体酶标记技术.doc

抗原、抗体酶标记技术-转自博升生物 酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体，酶标记的抗原或抗体称为结合物（conjugate）。抗原由于化学结构不同，可用不同的方法与酶结合，如为蛋白质抗原，基本上可参考抗体酶标记的方法。酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，作为抗体标记的酶常用的有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP），不同的酶标记方法也不相同。 1、辣根过氧化物酶（HRP）标记 辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）广泛分布于植物中，因辣根中含量最高而得名，由无色酶蛋白和深棕色铁卟啉（辅基）构成一种糖蛋白（含糖18%）。此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。辣根过氧化物酶（HRP）标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG后该醛基与 IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。 标记步骤： (1)　称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。 (2)　于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO４溶液，室温下避光搅拌20分钟。 (3)　将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。 (4)　加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0～9.5，然后立 即加入10mg IgG(抗体，或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小 时。 (5)　加0.1ml新配的4mg／ml NaBH４液，混匀，再置4℃2小时。 (6)　将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4 PBS透析，4℃过夜。 (7)　在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。 (8)　3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。 (9)　将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。 2、碱性 磷酸酶（AP）标记 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP），是小牛肠粘膜和大肠杆菌中提炼出来的一种磷酸酯的水解酶，由多个同功酶组成。常用的酶底物有对硝基本磷酸盐（PNP）、β-甘油磷酸钠。、碱性 磷酸酶（AP）用于标记抗体，常用戊二醛一步法，戊二醛是一种双功能团试剂，可以使酶与蛋白质或其他抗原的氨基通过它而偶联。戊二醛交联可用一步法（如连接AP），将酶、抗体、戊二醛按一定比例混合，经透析除去标记物中剩余的戊二醛，制得酶标抗体。也可用二步法（如连接HRP）。戊二醛一步法操作简便、有效，而且重复性好。缺点是交联时分子间的比例不严格，大小也不一，影响效果。制备HRP抗体结合物也可用二步法，即先将HRP与戊二醛作用，透析除去戊二醛，在pH9.5缓冲液中再与抗体作用而形成酶标抗体。此法的效率可高于一步法10倍左右。