qpcr实验操作流程.pdf

- . Q-PCR 实验流程 一、 ①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯翻 开 15-20 分钟。②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄 膜手套，RNA 抽提需带口罩。③取 EP 管/枪头时需用镊子，不可以 用使用过的手套直接取用。取完 EP 管/枪头后，袋子及时封好。④橡 胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移 液器在一天工作完毕后调至最大量程，并用 75% 乙醇清洁移液器，枪 头盒及超净台面。⑤实验进展的过程中或观看实验时，没有带口罩不 要在超净台前讲话。 二、 总 RNA 抽提 1〕细胞培养皿中细胞样品用 1*PBS 洗两次后，用 1ml 枪将 PBS 吸干净， 参加 1ml Trizol 〔Invitrogen 〕溶液，吹打混匀，并吸至 1.5ml RNase free EP 管中使细胞充分裂解，室温静置 5min ； 组织样品用液 氮充分研磨 ，参加 1ml Trizol 〔Invitrogen 〕溶液，混匀， 室温放置 5min 使其充分裂解；〔管盖与管壁都需标记样品名称〕 2）参加 200μl 氯仿，剧烈振荡混匀 30s ，使水相和有机相充分接触 ，室温 静置 3-5min ；〔离心时离心管按顺序排放， 离心完毕，离心管的顺序 也按顺序排好，与第一步的顺序一致〕 3 〕 4℃下 ，14,000g 离心 15min ，可见分为三层，RNA 在上层水相 ，移至 另一个新的 RNase free EP 管；〔用 20-200ul 的枪吸取上清，吸上清时， 枪头应沿着 液面上层吸取上清，枪头不可碰 到、吸到中间层〕 - .word.zl. - . 4）沉淀 RNA ：参加等体积异丙醇，轻柔地充分混匀〔颠倒6-8 次〕〔不 应用振荡器混匀〕，室温静置 10min ； 5）4℃下，14,000g 离心 10min ，收集 RNA 沉淀〔如离心后仍不见 EP 管 底部有沉淀，应将 EP 管放置在-80 度冰箱过夜，继续在 4℃下，14,000g 离心 10min ，收集 RNA 沉淀〕，去上清； 6）用 75 ％乙醇洗涤两次〔12,000g 离心 5min〕〔参加乙醇后只需轻轻颠 倒 EP 管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀〕，超净台风干；沉淀不 能过干或过湿，过干那么不易溶解，过湿那么乙醇残留。 7）视沉淀量参加适量 DEPC 水〔至少 15ul〕溶解沉淀。 三、去基因组 使用 RNase-free 的 DNase І 〔Promega 〕，按以下体系配置反响液，37℃ 消化 30min ，65℃灭活 10min。 RNA 30 µl DNase І 20 µl 10 x buffer 10 µl H2O(RNase free) 39.5