第三章植物基因工程载体及其构建.ppt

4、Ti质粒的生物学功能 为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力； 为寄主细胞合成植物激素IAA和细胞分裂素； 诱发植物产生冠瘿瘤并决定所诱导的肿瘤的形态学特征和冠瘿碱成分； 赋予寄主菌株分解代谢各种冠瘿碱的能力； 赋予寄主菌株对土壤杆菌素的反应性； 决定寄主菌株的植物寄主范围； 抑制某些根瘤农杆菌噬菌体的生长和发育。 第六十二页，共九十四页，2022年，8月28日 4、Ti质粒的改造 Ti质粒分子量过大，200kb左右，难以操作； 分布着各种限制酶的多个切点，难以找到可利用的单一限制性内切酶位点； T-DNA区Onc基因的产物干扰宿主植物中内源激素的平衡，诱发肿瘤，阻碍细胞的分化和植株的再生； Ti质粒不能在大肠杆菌中复制, 即使得到重组质粒，也只能在农杆菌中进行扩增；而农杆菌的转化率极低（10％左右）拷贝数少； Ti质粒上还存在一些对于T-DNA转移不起任何作用的序列。 野生型Ti质粒直接作为植物基因工程载体，存在如下障碍： 第六十三页，共九十四页，2022年，8月28日 一元载体和双元载体 第六十四页，共九十四页，2022年，8月28日 第六十五页，共九十四页，2022年，8月28日 第六十六页，共九十四页，2022年，8月28日 9、PCR产物克隆载体 （1）T载体 PCR产物往往在3’端突出一个或多个A， 将T-载体的MCS中部已经切开，各有一个3’端突出的T。 所以能与这个载体直接连接，这种克隆称为T-A克隆。 目前，目的基因的获得几乎都是用PCR的方法，如何将PCR产物连接到载体上？ 克隆载体线性化； 克隆载体末端补平； 克隆载体末端加T。 第三十页，共九十四页，2022年，8月28日 商业化T载体 一般来说，商业化的T载体多是先使用平端限制性内切酶（如EcoRV）将克隆载体进行线性化，然后再单独加入dTTP和Taq酶72～75℃反应，进行末端的加T。 自制T载体 一种常见的自制方法是利用限制性内切酶制造出具有单个T末端突出的片段，最常用的内切酶为XcmI，其识别和切割特点如下： 第三十一页，共九十四页，2022年，8月28日 第三十二页，共九十四页，2022年，8月28日 第三十三页，共九十四页，2022年，8月28日 TOPO技术 拓扑异构酶I在位点CCCTT切断并松弛超螺旋DNA，然后重新连接末端。这样，其同时作为限制酶和连接酶。 TOPO克隆是一种将拓扑异构酶与 T- 载体相结合的 PCR 产物快速克隆系统 pCR-TOPO ，无需 DNA 连接酶做连接。 3末端的突出 T 上共价结合了一个拓扑异构酶 Ⅰ ，当带 3 末端的突出 A 的 PCR 产物与该 T 载体互补配对时，拓扑异构酶 Ⅰ 就将该缺口连接起来。 第三十四页，共九十四页，2022年，8月28日 因为越来越多高确限度热稳定酶如Pfx、Pfu被用于PCR扩增，使到PCR后都只是平端产物。这种平端克隆往往效率低，并且有非特异性背景菌落产生，造成筛选困难。 （2）平末端PCR产物载体 第三十五页，共九十四页，2022年，8月28日 TOPO-Blunt载体 在 lacZ’基因的下游融合了一个 ccdB （Control of cell death）基因，该基因对大肠杆菌是致死的。 载体切成线状，再与目标 DNA 连接，转化大肠杆菌。 外源 DNA 片段与载体连接后，ccdB 基因的表达受到阻断，重组质粒才能在大肠杆菌中存在下来。 如果没有DNA片断插入，ccdB基因则会表达，造成细菌染色体的降解导致细菌死亡。 第三十六页，共九十四页，2022年，8月28日 TOPO克隆高效性原理 Topo连接反应有两个分子参与，而传统的连接反应有三个分子参与，其热力学上的优势导致5分钟的快速连接。 第三十七页，共九十四页，2022年，8月28日 10、质粒提取 细菌培养和富集 细胞悬浮 细胞破碎 细胞碎片基因组去除 蛋白去除 质粒收集 溶液1：50 mM葡萄糖，25 mM Tris-Cl，10 mM EDTA，pH 8.0 溶液2：0.2 N NaOH ，1% SDS； 溶液3：3 M 醋酸钾 ，2 M 醋酸 苯酚、氯仿抽提 异丙醇/乙醇沉淀，70%乙醇清洗 第三十八页，共九十四页，2022年，8月28日 具备复制原点，在宿主细胞内能够自主复制； 具备合适的酶切位点，供外源片段插入； 含有供选择转化子的标记基因； 适当的拷贝数：较高的拷贝数，便于回收、制备； 载体的安全性：对受体细胞无毒害，不能随便转移； 载体大小：原则上要求载体越小越好； 如果需要外源基因的表达：启动子。 载体应具备的条件 第三十九页，共九十四页，2022年，8月28日 11、大肠杆菌感受态制备及转化 （1）热激法 挑选单菌落 过夜振荡培养 取1ml菌液+50ml培养基 2-3h，OD