脂肪组织中分离巨噬细胞实验步骤.docx

?本期小助手帮大家详解一个细胞实验，从鼠的脂肪细胞中分离巨噬细胞的实验，步骤多、操作繁琐，但别急，跟着小助手一步一步来做，话不多说，上干货。 实验步骤 01?分离 ??用 PBS清洗脂肪组织，并将组织放在冰上的培养皿中，用剪刀将组织切成小块（约3-5mm）。 ??将切碎的组织转移到含有7mL冰冷消化缓冲液的10mL圆底管中，此操作需一直保持在冰上。对于1g的脂肪，将组织切碎并转移到含有10mL冰冷消化缓冲液的50mL锥形管中。 ??加入1mL（如脂肪组织重量1g则可以增加至1.5mL）10×?胶原酶缓冲液，并加入消化缓冲液使得胶原酶的最终浓度为1mg/mL。 ??在37°C下孵育半小时，且使试管剧烈摇晃。每10分钟大力摇动试管，可获得更高的细胞产量。30分钟后，取10μL产物进行显微镜观察，此时，脂肪细胞应显示为大的单细胞，白细胞和其他基质细胞会小得多。如果白细胞仍附着在脂肪细胞上，则应继续消化；如果没有，请继续下一步。 ??消化后，将EDTA添加到10 mM的最终浓度，并在37°C下再孵育10分钟。 02?过滤 ??用 PBS预湿100?μm尼龙过滤器，然后放置在50mL锥形管上。使用移液管，将前述样本的细胞沉淀先转移到过滤器上过滤，然后再过滤含有脂肪细胞的上层。 ??加入10 ml FACS 缓冲液轻轻清洗过滤器两次。 03?离心 ??在4?°C下以500×g 离心10分钟以分离脂肪细胞和巨噬细胞。离心后，脂肪细胞在顶部形成白色层，而巨噬细胞等其它细胞在管底部形成红色或白色沉淀。 ??轻轻吸出并丢弃脂肪细胞和上清液。此时，含有巨噬细胞的团块很容易受到干扰，因此应格外小心。 04?获取巨噬细胞 ??通过轻弹试管将沉淀重悬于0.5 mL红细胞裂解液中。在室温下孵育5分钟，偶尔轻轻摇晃。 ??通过添加5 mL FACS缓冲液，中和红细胞裂解作用。 ??在4?°C下以500×g 离心10分钟。 ??在3—5 mL FACS缓冲液中重悬细胞沉淀并在冰上孵育。 05?巨噬细胞计数 ??将10?μL每个样品1:1与台盼蓝溶液混合。使用血细胞计数板仔细计数活细胞。根据计数得到的细胞数量，结合获得的样本总体积，可计算出每份脂肪组织巨噬细胞产量。典型的产量：瘦小鼠一般为1-3×1000000个细胞/g脂肪，肥胖小鼠一般为2-5×1000000个细胞/g脂肪。 注意事项 尽可能切碎组织，在消化过程中频繁手动摇动增加接触面积。2、胶原酶消化脂肪组织时，碎组织大小、摇动强度和孵育时间是关键参数，应对其进行优化，以最大限度地提高从脂肪提取巨噬细胞的产量。3、胶原酶的消化时间应根据每批胶原酶分别进行优化。增加胶原酶缓冲液中的孵育时间，尤其是超过1小时，会显著降低细胞产量并增加细胞死亡几率。 来源：“MDL科研助手”公众号说明：转载只为分享目的，如有侵权请联系删除，谢谢！