第4章-基因工程载体(植物基因工程)PPT幻灯片.ppt

本章重点掌握的内容掌握载体、克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、α-互补、插入失活、人工染色体载体的概念。 克隆载体DNA分子具备的条件。 标记基因的分类及其作用。 质粒克隆载体用途。 λ-DNA载体的构建、类型及其优点。 植物表达载体的组成、启动子的类型等 遗传物质 + 载体 重组的DNA分子 引入细胞或生物体内 复制与表达 稳定地遗传给下代 为什么要用到载体？ 基因工程流程图 载体的功能载体的功能 运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 为外源基因提供整合能力 载体的要求A、复制起点：能在受体中复制；B、选择标记和筛选标记；C、限制性内切酶切割位点（多克隆位点）；D、载体的大小：原则上要求载体越小越好；E、适当的拷贝数；F、载体的安全性：质粒不能随便转移;G、外源基因的表达：启动子。 大肠杆菌质粒载体 pBR322结构图 复制起点? 选择标记基因克隆位点克隆位点 载体的分类按功能分类 　克隆载体　克隆一个基因或DNA片断 　表达载体　用于一个基因的蛋白表达 　整合载体　把一个基因插入到染色体组中 按来源分类 　质粒载体 　噬菌体载体 　柯斯质粒载体 　人工染色体载体 载体的种类和特征质粒受体细胞结构插入片断举例 E.coli环状＜ 8kbpUC18/19 , pBR322等 λ噬菌体载体E.coli线状9 - 24kb EMBL系列， λ gt系列丝状噬菌体及噬菌粒载体E.coli环状＜ 10 kbM13mp系列粘粒载体载体E.coli环状35- 45kbpJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV BAC (Bacterial Artificial Chromosome)载体E.coli环状≈300 kb pBeloBAC11YAC (Yeast Artificial chromosome )载体酵母细胞线性染色体 100 - 2000 kbpYAC4MAC (Mammalian Artificial Chromosome)载体哺乳类细胞线性染色体＞ 1000 kbpCXLamIntWT, pCXLamIntR and pCXLamIntROK病毒载体动物细胞环状SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体穿梭载体动物细胞 和细菌环状pSVK3质粒，PBV, Ti质粒 第一节 克隆载体 一、质粒载体1.质粒的概念 质粒（plasmid)是一种存在于细菌或真菌染色体外的小型环状双链DNA 分子，可自主复制和表达。 并不是寄主生长所必需的，但可以赋予寄主某些抵御外界环境因素不利影响的能力（带有抗性基因等） 。 分子量在1-200kb之间 。 一、质粒载体大肠杆菌的质粒 一、 质粒载体2.质粒的空间构型 　　①共价闭合环状DNA（Covalent close circular DNA，cccDNA) 　　　呈超螺旋（SC）（super coil） 一、 质粒载体② 开环DNA（ open circular， ocDNA） 　　　一条链上有一至数个缺口。 ③ 线形DNA （ linear ，LDNA） 一、 质粒载体　　　同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同： 　　　SC DNA最快、L DNA次之、OC DNA最慢。 SC OC L 一、 质粒载体3.质粒的基本特性 　质粒的自主复制性 　质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制。 　质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系。根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒（stringent plasmid） (拷贝数少，为1-5个)和松弛型复制控制的质粒（relaxed） (拷贝数多，可达10-200个拷贝) 因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。 质粒 复制子 拷贝数 pBR322 及其衍生质粒 pMB1 15～20 pUC 系列质粒及其衍生质粒 突变的 pMB1 500～700 pSC101 及其衍生质粒pSC101 ～5 ColE1ColE115～20 一、质粒载体质粒的不相容性(incompatibility,又称质粒的不亲和性) 　 两种质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性。具有不相容性的质粒组成的群体称为不相容群，一般具有相同的复制子。 　　　以大肠杆菌的质粒为例： 　 ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 　 pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 　 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容 一、 质粒载体质粒的可转移性 　　 接合型质粒　能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用）。　 非