在小鼠脑血管内皮细胞中用发夹寡核苷酸调控由细胞因子诱导的iNOS的表达PPT幻灯片.pptVIP

本文主要内容 在MCEC中，TNF-α和IFN-γ的组合可增强iNOS的表达； 在MCEC中，NF-κB对由TNF-α及IFN-γ诱导iNOS的表达起介导作用； 设计了一个携带NF-κB基序的双链发夹寡核苷酸，并证明该核苷酸可以抑制上述作用。 背景资料 一氧化氮合酶（NOS）的三种同工酶： 神经元型一氧化氮合酶（Neuronal nitric oxide synthase，nNOS或NOS1） 内皮型一氧化氮合酶（Endothelial nitric oxide synthase，eNOS或NOS3） 诱导型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase，iNOS或NOS2） 促炎性细胞因子： 肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor alpha，TNF-α） 干扰素-γ(Interferon gamma， IFN-γ) 背景资料 细胞因子可通过核转录因子-κB（Nuclear factor kappa-B， NF-κB）的发挥它们的作用，以改变基因表达。 在小鼠脑血管内皮细胞（MCECs）中，IFN-γ与TNF-α的共同作用能增加的NF-kB（与DNA）的结合力（binding），进一步增加iNOS的表达。 转录因子活性可以通过反义寡核苷酸（Antisense oligonucleotides）或双链哑铃寡核苷酸（Double-stranded dumbbell oligonucleotides）来调节。 实验目的 测试含有NF-κB结合位点（binding site）共有序列的双链发夹（Hairpin，HP）寡核苷酸的功效 （有效抑制细胞因子诱导的iNOS表达）。 实验方法 对iNOS表达的诱导 含TNF-α(20 ng/ml)、IFN-γ(1,000 units/ml)的培养基 时间梯度 对iNOS表达的调节 NF-kB发夹核苷酸(1μM) 或突变型NF-kB发夹核苷酸(1μM) TNF-α、IFN-γ诱导前3h加入（预处理） MCEC核提取物的制备 每样约500万个细胞 RNA分离（TRI reagent法） 实验方法 发夹由TTTTT连接环建立，在NF-kB的共识寡核苷酸标有γ-32P-ATP 室温下孵育（结合反应，Binding reaction）后非变性电泳 放射自显影 电泳迁移分析 NF-kB的共有寡核苷酸 5‘-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’(32) HP寡核苷酸 AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGCTT T TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCGTT 突变HP寡核苷酸 AGTTGAGTCTACGCTAACAGGCTT T TCAACTCAGATGCGATTGTCCGTT 实验方法 RT-PCR 亲环蛋白（内参基因引物）: +5’-ATGGTCAACCCCACCGTGT-3’; -5’-CGTGTGAAGTCACCACCCT-3’ (220 bp). iNOS（目的基因引物）: +5’-TATGAAGTTATGGGATGTCGTGGCT-3’; -5’-TAGATACATCCACACCGTTTAGCGG-3’ (300 bp). 蛋白印迹（见Promega技术手册） 实验结果 图1 MCEC中HP寡核苷酸及其突变体对NF-kB结合活性的影响 TNF-α+IFN-γ增加MCEC中NF-kB的结合活性（图1A） 1.空白对照 2.未处理（对照）组 3. TNF-α+IFN-γ处理组 TNF-α+IFN-γ处理后， MCEC中NF-kB的结合活性是原来的3倍以上！！！ 实验结果 图1 MCEC中HP寡核苷酸及其突变体对NF-kB结合活性的影响 同一凝胶板下HP寡核苷酸及其突变体对NF-kB结合活性的影响（图1B） 1.空白对照 2.核蛋白（同1A处理组）+ NF-kB标记探针 3. 20×NF-kB非标记探针 4. 20×HP寡核苷酸预处理影响组 5. 20×突变HP寡核苷酸预处理影响组 TNF-α+IFN-γ处理后，发夹寡核苷酸预处理操作能抑制NF-κB结合活性，而突变发夹寡核苷酸预处理操作对NF-κB结合活性则没有效果！！！ 实验结果 图2 MCEC中HP寡核苷酸和它的突变体对TNF-α+IFN-γ诱导iNOS表达的影响（RT-PCR检测）。 TNF-α+IFN-γ增加MCEC中iNOS的表达（图2A） 1. TNF-α+IFN-γ处理后0h（未处理组） 2. TNF-α+IFN-γ处理后1h 3. TNF-α+IFN-γ处理后3h 4. TNF-α+IFN-γ处理后5h 5. TNF-α+IFN-γ处理后24h TNF-α+IFN-γ处理后， MCEC中iNOS mRNA瞬