基因工程实验流程总览课件[].ppt

基因工程实验流程总览;DNA提取，纯化;RNA提取;构建基因组文库;油菜TOC33基因片的克隆;具体实验步骤;Ⅰ.植物基因组DNA的制备;Ⅱ.TOC33基因片段的PCR扩增;琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果 1)?称取0.5g琼脂糖放入溶胶瓶中，再加入1ml 50×TAE缓冲液，49ml 高水，置微波炉或水浴加热至完全融化，取出摇匀，则为1％琼脂糖凝胶液。 2)???取电泳槽里面的胶板，用胶带将两端封好，调平，并放好样品梳子。 3)?将冷到60oC左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入胶板，直至胶板上形成一层均匀的胶面。 4)?待胶凝固后，取出梳子，放在电泳槽内。电泳槽内应加入电泳缓冲液。 5)??用移液枪将已加入上样缓冲液的PCR产物加入加样孔。 6)?接通电泳槽和电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）；选择合适的电压，开始电泳； 7)??当溴酚蓝燃料移动倒距离凝胶前言1－2cm处，停止电泳。 8)?将电泳的凝胶浸入溴化乙锭染色液中，染色10min后取出，用清水冲洗。将胶放于凝胶成像系统内拍照，以观察样品在琼脂糖凝胶中的带（EB有剧毒，戴手套操作）。;电泳染色后，在紫外分析仪上切取所需要的条带，按1克胶：1000添加提取缓冲液，放在60度的金属浴中溶解。然后把溶液转移到试剂盒专用管中，6000转/分离心1分钟； 倒掉上清，再加入500微升的extraction buffer,12000r/min离心1分钟； 倒掉上清，加入750微升的wash buffer ,12000r/min离心1分钟； 倒掉上清，重复步骤三； 倒掉上清，在12000r/min下空转1分钟； 把带有膜的管子换到新的EP管中，加入30~50微升的水，静置1分钟，12000r/min离心一分钟，即得到所要回收的片断。此样品可用来做酶切等。;IV. DNA片段的体外重组 加试剂顺序由上到下（用500ul的EP管装），加完之后混匀，短时离心，用封口胶封口。 将EP管放入金属浴当中37度酶切两个半小时左右，取出酶切产物，用试剂盒进行割胶回收进一步纯化酶切片断以进行连接反应。;IV. DNA片段的转化 1.???? 从液氮中取出感受态细胞，完全融化后，用移液枪将连接产物加入感受态细胞中，温柔混匀，在冰上放置半个小时。 2.???? 42OC热激90sec。再在冰上放10min，然后导入SOC（1.5mlEP管）中，在37OC摇床上200rpm进行振荡??小时。 3.???? 在这段时间里可以准备平板，25ml左右加了抗生素的60度左右的LB固体培养基倒入事先灭菌的培养皿中，在表面涂布上X-gal和ITPG; 4.???? 取出摇得菌液在离心机上6000转每分钟离心五分钟。然后将大部分培养基倒出，剩余大概五十微升左右的SOC即可。注意不可将沉淀倒出。 5.???? 用移液枪将沉淀吹散均匀，将其加入事先倒好的平板上，加入涂布玻璃珠进行涂布。涂布均匀后将平板倒置放于37OC培养箱内过夜培养。第二天从转化的平板上挑去白色的菌落以验证是否是阳性克隆;V. 克隆的筛选与鉴定 1.??用移液枪在1.5mlEP管中加入液体LB培养基500ul，再用灭过菌的牙签在生长蓝白斑的平板上挑取阳性克隆放于EP管中，丢弃牙签，盖紧管口，用报纸包好放到37OC，200r/min的摇床中过夜培养； 2.???EP管出现混浊，用质粒提取试剂盒提取质粒。 3.??对于得到的质粒再酶切电泳检测阳性克隆，如果酶切后的电泳图上出现了与插入片断相应大小的条带，证明是此单菌落是阳性克隆，否则是假阳性的。 ;试剂盒质粒回收过程 ;VI.序列分析;实验起始材料的选取和准备 mRNA的提取、纯化 目标片段的克隆和分析 DNA、RNA的提取、纯化和分析 克隆化基因的表达及表达蛋白的纯化和功能分析 基因转化实验及转基因结果分析 ;一、实验起始材料的选取和准备;二、卵细胞mRNA的提取、纯化;三、目标片段的克隆和分析;1.通过SMART技术构建cDNA文库;2.目标基因的克隆;四、DNA、RNA的提取、纯化和分析;质粒提取、分析;水稻基因组DNA的提取、纯化和分析;水稻各器官Total RNA的提取、纯化和分析;Southern blotting;克隆化基因的表达及表达蛋白的纯化和功能分析;克隆化基因的表达;表达蛋白的纯化;目标蛋白功能分析;蛋白体内表达研究;基因转化实验和转基因结果分析;;连接反应;感受态菌的制备;pMal-ade重组质粒的转化;UNIQ-10柱式质粒小量抽提;PCR筛选;3．PCR 反应循环条件设置 94℃变性反应1min； 55℃退火反应45s； 72℃延伸反应1min。 进行25个循环后，最后一个循环72℃延长至10min。迅速冷却4℃。 4、检测