基因芯片的操作流程及步骤课件[].ppt

离体新鲜组织，切成多个1cm3小块，剔除结缔组织和脂肪组织。胃、肠组织应剪除外膜；肝、肾、脾应剪除门部血管神经，肿瘤组织应将周围的正常组织切除干净（正常组织也应将周围的肿瘤组织切除干净）。 在RNase-Free 0.9％生理盐水中漂洗样品，以去除血渍和污物。 用铝箔包裹组织，或用5ml冻存管装载组织(但最好统一采用铝箔)。用记号笔在铝箔或冻存管外表写明样品编号，并贴上标签，迅速投入液氮冷却。 填写样品登记表，写明样品名称、种类、编号、取样日期、样品处理情况等将液氮冷却的组织放入样品袋（每个样品袋只保存同样的组织），袋口留一根编号绳，绳上粘一张标签纸（标签上注明：样品名称、编号、日期），迅速转入便携式液氮罐 保留1-2张取材部位的病理切片。 以上步骤应在冰上进行且不超过15分钟，超过时间会导致样品的RNA降解。 对肿瘤组织的取材，要求尽可能准确地判定肿瘤和正常组织，例如对于手术切除的整个或部分前列腺，可能要根据冰冻切片报告的结果来判定要进行研究的取材部位。 3.基因芯片杂交 待分析基因在与芯片结合探针杂交之前必需进行分离、扩增及标记。根据样品来源、基因含量及检测方法和分析目的不同，采用的基因分离、扩增及标记方法各异。当然，常规的基因分离、扩增及标记技术完全可以采用，但操作繁琐且费时。 高度集成的微型样品处理系统如细胞分离芯片及基因扩增芯片等是实现上述目的的有效手段和发展方向。 为了获得基因的杂交信号必须对目的基因进行标记，目前采用的最普遍的荧光标记方法与传统方法如体外转录、PCR、逆转录等原理上并无多大差异，只是采用的荧光素种类更多，这可以满足不同来源样品的平行分析。 用计算机控制的高分辨荧光扫描仪可获得结合于芯片上目的基因的荧光信号，通过计算机处理即可给出目的基因的结构或表达信息。 杂交条件的选择与研究目的有关，多态性分析或者基因测序时，每个核苷酸或突变位点都必须检测出来。 通常设计出一套四种寡聚核苷酸，在靶序列上跨越每个位点，只在中央位点碱基有所不同，根据每套探针在某一特点位点的杂交严谨程度，即可测定出该碱基的种类。 如果芯片仅用于检测基因表达，只需设计出针对基因中的特定区域的几套寡聚核苷酸即可。 表达检测需要长的杂交时间，更高的严谨性，更高的样品浓度和低温度，这有利于增加检测的特异性和低拷贝基因检测的灵敏度。突变检测，要鉴别出单碱基错配，需要更高的杂交严谨性和更短的时间。 基因芯片的操作流程 基因芯片流程（一） 1. 实验设计 2. 样品制备（指mRNA或总RNA样品，包括对照组和实验组。将mRNA或总RNA分别进行逆转录生成cDNA，然后将对照组和实验组cDNA分别标记Cy3和Cy5荧光信号） 3. 芯片制备（寡核苷酸探针或 cDNA探针，包括PCR，纯化，点样等步骤） 例 基于芯片的基因测序 基因芯片流程（二） 4. 芯片杂交（将用Cy3和Cy5荧光标记的对照组和实验组的cDNA 等量混合，与芯片进行杂交） 5. 芯片扫描（采用激光扫描仪，分别用532nm和635nm波长激光扫描芯片，对于每张芯片，得到Cy3和Cy5通道两幅图象） cDNA spotted microarrays 基因芯片流程（三） 6.. 图象处理（采用专门软件，对图象进行分析，提取每个点上的数字信号，得到原始数据表） 7. 数据校正和筛选（对Cy5或Cy3信号进行校正，消除实验或扫描等各环节因素对数据的影响，同时利用筛选规则对数据中的“坏点”，“小点”，“低信号点”进行筛选，并作标记） 基因芯片流程（四） 8. 目的基因或序列的确定（采用ratio值对差异基因进行判断，或采用统计方法如线性回归、主成分分析、调整P值算法等对差异基因进行统计推断） 9. 生物信息学分析（如cluster 算法、差异基因的同源性比对，差异基因的相关文献检索等） 微流控芯片检测仪 基因芯片的阅读分析系统 芯片扫描仪 芯片杂交盒 三、 基因芯片设计步骤 1. 基因芯片设计的一般性原则 基因芯片设计主要包括两个方面: 探针的设计 指如何选择芯片上的探针 探针在芯片上的布局 指如何将探针排布在芯片上。 确定芯片所要检测的目标对象 查询生物分子数据库 取得相应的DNA序列数据 序列对比分析 找出特征序列，作为芯片设计的参照序列。 数据库有哪些信誉好的足球投注网站 得到关于序列突变的信息及其它信息。 在进行探针设计和布局时必须考虑以下几个方面： (1)互补性 (2)敏感性和特异性 (3)容错性 (4)可靠性 (5)可控性 (6)可读性 基因芯片使用步骤 芯片制作 把探针固定于载体表面 样品处理 目标分子富集 分子间的杂交 结果检测与数据分析 基因芯片的制作方式 原位合成 直接点样