基因组编辑技术课件[].ppt

基因组编辑;基因编辑的定义： 通过精确识别靶细胞DNA片段中靶点的核苷酸序列，利用核酸内切酶对DNA靶点序列进行切割，从而完成对靶细胞DNA目的基因片段的精确编辑。 ;基因编辑的优势;基因编辑原理; 第一代: ZFN(锌指核酸酶) 第二代: TALEN(转录激活样效应因子核酸酶) 第三代: CRISPR/Cas9(成簇的规律性间隔的短回文重复序列) 第四代：NgAgo - gDNA 韩春雨; ZFN 基因组编辑技术;ZFN=DNA识别域+核酸内切酶 DNA识别域： 由一系列 Cys2-His2锌指蛋白（zinc-fingers）串联组成（一般3~4个），每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。 核酸内切酶： 非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体时切割双链DNA。;ZFN 由锌指蛋白(ZFP)和 FokⅠ核酸内切酶组成。其中，由 ZFP 构成的 DNA 识别域能识别特异位点并与之结合，而由FokⅠ构成的切割域能执行剪切功能，两者结合可使靶位点的双链DNA 断裂(DSB)。于是， 细胞可以通过同源重组(HR)修复机制和非同源末端连接(NHEJ)修复机制来修复 DNA。HR 修复有可能会对靶标位点进行恢复修饰或者插入修饰，而 NHEJ 修复极易发生插入突变或缺失突变。两者都可造成移码突变，因此达到基因敲除的目的。; ZFN 诱导的基因组编辑技术可应用于很多物种及基 因位点，具有较好的发展潜力。 缺点: (1)以现有的策略设计高亲和性的 ZFN，需要投入大量的工作和时间;(2)在细胞中持续表达 ZFN 对细胞有毒性;(3)虽然三联体设计具有一定特异性，但仍然存在不同程度的脱靶效应。;TALEN 基因组编辑技术; TALENs 包含两个 TALEN 蛋白, 每个 TALEN 都是由 TALE array 与 FokⅠ融合而成. 其中一个 TALEN 靶向正义链上靶标位点, 另一个则靶向反义链上的靶标位点. 然后 FokⅠ形成二聚体, 在靶向序列中间的 spacer 处切割 DNA, 造成双链 DNA 断裂, 随后细胞启动 DNA 损伤修复机制. 针对不同的TALEN 骨架, 其最适宜的spacer长度不同, 其长度范围一般为12~20 bp. ; 实验结果表明, TALENs在靶向DNA时, 第一个碱基为 T 时其结合效果更佳。 通过组合各类模块，可对任意核苷酸序列进行靶向特异性敲除或内源基因的表达调控。 目前已在人、大鼠、小鼠、猪、羊、斑马鱼、拟南芥及酵母等多类物??中得到成功应用。;CRISPR /Cas9 基因组编辑技术 CRISPR/Cas9系统的发现可以追溯到1987年，日本学者首次在大肠杆菌(E. coli)基因组中发现一连串短的空间间隔重复序列。随后，在其他细菌和古细菌中也发现了这一特殊的序列。 2002年科学家才将其命名为成簇的规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR) ，现有测序结果显示40%的细菌基因组中含有CRISPR位点。 2005年，科学家们发现CRISPR中的许多间隔序列来源于质粒和病毒，CRISPR的基因座能够被转录，并且Cas基因编码的蛋白具有核酸酶和解旋酶结构域，因此推测CRISPR/ Cas 是利用无义的RNAs标记外源核酸序列的防御系统。; 2011年，才揭示了CRISPR/Cas系统的分子机制：当病毒首次入侵时，细菌会将外源基因的一段序列整合到自身的CRISPR的间隔区；病毒二次入侵时，CRISPR转录生成crRNA前体(pre-crRNA)，pre-crRNA经过加工形成含有与外源基因匹配序列的 crRNA，该crRNA与病毒基因组的同源序列识别后，介导Cas蛋白结合并切割，从而保护自身免受入侵。 2013年，研究者报道了CRISPR/Cas9系统可高效地编辑基因组。其中分别在人类细胞和小鼠细胞中成功对部分基因实现了编辑。 ; CRISPR/Cas系统概述 CRISPR/ Cas系统广泛存在于细菌和古菌中，是它们的一种适应性免疫系统，能够识别自身和外源入侵DNA片段。CRISPR/ Cas系统有3种类型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。 Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas系统较为复杂，需要多个Cas蛋白形成复合体切割DNA双链，而Ⅱ型CRISPR/Cas系统只需要一个Cas9蛋白核酸酶来切割DNA双链,即为现在广泛应用于遗传学基因编辑的CRISPR/Cas9系统。 TypeⅡ系统中只有一种核酸酶—Ca