基因表达沉默技术课件[].ppt

药学系药物基因组学教研室 2010.06.18 ;教学内容及要求;参考资料;第一节 RNA干扰技术;基本概念;注射;反义RNA(antisense RNA)对基因抑制效应比较微弱； 而双链RNA（dsRNA）能够高效特异性阻断靶基因的表达。 ; Craig C. Mello克雷格·梅洛;随后陆续发现RNAi也存在于水稻、烟草、果蝇、小鼠及人等几乎所有的真核生物中。;靶;siRNA;1）靶序列的调出;13;14;2）利用免费设计软件进行siRNA设计;软件的选择原则;我用的软件：siDirect;3）siRNA合成或表达;19;20;21;3 mg/ml 正向引物 1 μl 3 mg/ml 反向引物 1 μl;4) siRNA working?;mRNA:Real-time PCR Protein: Western blot;5)合成or构建载体？;6）体外导入细胞;b.电穿孔导入：;c.病毒感染（以腺病毒为例）：;29;;1978年，Stephenson 和Zamecnik首次报道了反义寡脱氧核苷酸可抑制劳斯肉瘤病毒RSV的复制现象。 1984 年，Izant weintraub提出了“反义核酸技术”的概念。;;反义抑制的主要机理; 论著超过１６０００篇。 基因功能研究（ 1994年流行） 如抗病毒或抗肿瘤基因治疗研究等领域。;1998年8月27日，美国食品药品管理局（FDA）正式批准了由ISIS公司开发的全球第一个反义药物“Vitravene” （福米韦生，fomivirsen）在美国上市。 该药抗病毒作用较强，是更昔洛韦的1000倍，用于治疗巨细胞病毒性视网膜炎和艾滋病人并发巨细胞视网膜炎,有效率高达80%-90%。 Vitravene为注射剂，患者每月只需注射一次药物（利用专用针头直接注射进眼球内），不良反应有虹膜炎、玻璃体炎，发生率为25％，用糖皮质激素治疗可缓解或消除其炎性反应。;a.避免内源性核酸酶对其降解 b.提高自身稳定性以及与靶分子的亲和力;第一代硫代修饰（Phosphorothioate）;第二代修饰(2’-O-methyl,2’-O-methoxyethyl);2001 主要用于治疗老年人中十分常见的视网膜黄斑退化症 ;??2003 新一代抗HIV新药，属于病毒的融合阻止剂类药物 ;Tysabri ;42;第三节 核酶技术;核酶（ribozyme） ribonucleic acid enzyme 具有催化活性的RNA，化学本质是RNA,却具有酶的催化功能。 ;; S.Altman研究发现发现大肠杆菌RNaseP的蛋白质部分除去后，留下RNA能够切割rRNA前体的5’端。;1989 Nobel Prize in Chemistry;;;50;第四节 基因敲除技术;发展历史;同源重组：是指发???在减数分裂或者有丝分裂过程中相同或者相似DNA序列间的重组，通常通过一对同源分子非姊妹染色体间的断裂而产生新的重组片段。;1985年，奥利弗·史密塞斯(Oliver Smithies) 等首次报道在肿瘤细胞中实现了人工打靶载体和内源β-球蛋白基因间的同源重组。;1988年，卡佩基安德等发展了一种称为“正负筛选”的策略，将胸腺嘧啶激酶基因（tk）置于打靶载体的外侧，作为筛选的负性标记。这比单用阳性筛选正确克隆富集的倍数高3~10倍，真正使得同源重组技术得以应用。;Martin Evans 马丁·埃文斯;原理和操作流程;58;小结;感想 药学系药物基因组学教研室 2010.06.18 ;教学内容及要求;参考资料;第一节 RNA干扰技术;基本概念;注射;反义RNA(antisense RNA)对基因抑制效应比较微弱； 而双链RNA（dsRNA）能够高效特异性阻断靶基因的表达。 ; Craig C. Mello克雷格·梅洛;随后陆续发现RNAi也存在于水稻、烟草、果蝇、小鼠及人等几乎所有的真核生物中。;靶;siRNA;1）靶序列的调出;13;14;2）利用免费设计软件进行siRNA设计;软件的选择原则;我用的软件：siDirect;3）siRNA合成或表达;19;20;21;3 mg/ml 正向引物 1 μl 3 mg/ml 反向引物 1 μl;4) siRNA working?;mRNA:Real-time PCR Protein: Western blot;5)合成or构建载体？;6）体外导入细胞;b.电穿孔导入：;c.病毒感染（以腺病毒为例）：;29;;1978年，Stephenson 和Zamecnik首次报道了反义寡脱氧核苷酸可抑制劳斯肉瘤病毒RSV的复制现象。 1984 年，Izant weintraub提出了“反义核酸技术”的概念。;;反义抑制的主要机理; 论著超过１６