肝胆肿瘤类器官培养用主要试剂材料与操作要点、STR、染色体核型检测、鉴定、类器官的核酸与蛋白质提取.docxVIP

PAGE PAGE 5 附 录 A （资料性） 肝胆肿瘤类器官培养用试剂材料与操作技术要点 1主要试剂材料 1.1 培养基主要构成 肝胆肿瘤类器官培养基的主要成份表 中文名称 英文名称 基础培养基 Advanced DMEM/F12 谷氨酰胺 GlutaMAX 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液 HEPES 青霉素/链霉素 penicillin/streptomycin N-乙酰半胱氨酸 N-acetylcysteine 尼可酰胺 Niacinamide 无血清添加剂 B27 表皮生长因子 EGF 纤维母细胞生长因子10 FGF10 肝细胞生长因子 HGF Wnt-3a **Wnt-3a 胃泌素I gastrin I Wnt信号通路激活剂 **R-Spondin1 头蛋白 **Noggin TGFβ抑制剂 A83-01 ROCK抑制剂* Y-27632 地塞米松(诱导细胞增值） **Dexamethasone 牛血清白蛋白 BSA MDM2 抑制剂/p53激活剂 **Nutlin3a **肿瘤培养可选者不加或低浓度使用 *分离培养前三天加。 *根据肿瘤样本和细胞本身存在的的heterogeneity，样本量足够大时可考虑调整成分，浓度看哪个条件更适合样本的培养。 1.2 类器官培养3D支架材料 3D基质胶提取自基底膜的基质，主要由层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白等组成，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等。基质胶在室温条件下聚合形成具有生物学活性的三维支架，模拟体内细胞外基质的结构、组成、物理特性和功能。该结构不仅有利于体外细胞的培养和分化，而且能够为胃肠道上皮细胞的生长提供支架。基质胶在零度以下低温环境呈液态，故凡是涉及基质胶的试验操作皆应置冰盒操作。 1.3 组织消化酶 肝脏组织消化中涉及的消化酶主要有IV型胶原酶（Collagenase IV）与 DNase I。其作用是水解肝脏ECM中的胶原蛋白成分，从而使肝脏细胞从组织中充分分离出来，以利于制备为单细胞悬液。 1.4 类器官冻存液 类器官冻存液为无血清冻存液，一般宜含有10%的二甲基亚砜 (DMSO)。 2肝脏类器官培养操作要点 2.1 类器官污染的处置 肝脏类器官培养过程中应定期观察、拍照。一般在第2天于倒置显微镜下可以观察到类器官小球，随着培养时间延长，类器官小球逐渐增多、增大。定期观察有利于及时发现污染。如果在培养3天内出现基质胶浑浊，提示可能有霉菌和细菌污染，应及时做丢弃处理。在类器官培养过程中也有可能出现支原体污染。支原体在培养基上呈现团状、小球状生长，容易与类器官混淆，但支原体在显微镜下观察不到上皮的组织细胞结构。若发现可疑支原体污染，可加入支原体去除剂进行挽救，支原体去除剂可以抑制并消除支原体的生长，若仍不能去除支原体污染则做丢弃处理。 2.2 类器官培养物接种注意事项 将获取的细胞悬液与3D基质胶按照1:1混匀吹打，吹打过程中切忌产生大量气泡，以免影响后续培养物接种。24孔板可提前于37℃培养箱预热30 min，以加速3D基质胶的凝固。 2.3 类器官传代注意事项 肝脏类器官可以连续传代超过10代或持续培养6个月以上。与类器官有关的试验研究宜在连续传代10代以内或者持续培养6个月内进行。 3 类器官冻存注意事项 冻存前每孔加入500μl的organoid harvesting solution,将类器官吸至试管内，按照50μl胶加500μl的organoid harvesting solution，置于冰上60min，去除基质胶，离心清洗后，加入Accutase 消化3-5min，使其消化成单细胞悬液，1000rpm离心5 min。弃上清后加入适量类器官冻存液混匀（1 ml左右），分装于500 μl低温冻存管中，放入程序性冻存盒内于-80℃深低温冰箱过夜保存，次日将冻存管转移至液氮罐中长期保存。 4 类器官复苏注意事项 从液氮罐中取出的类器官冻存管要应快速放入37℃水浴锅中令其尽快融化。吸出类器官冻存物移至15ml无菌离心管中，再加入10倍体积的Advanced DMEM/F12培养基混匀。之后操作同前述的类器官传代培养过程。 附 录 B （资料性） STR检测 首先了解下STR检测流程，先提取细胞DNA, 然后进行PCR扩增及测序，最后进行结果分析。详细检测流程请看下图： 人源类器官STR鉴定结果判定标准： 受检类器官STR位点的基因分型数据与其对应的标准细胞系（其原始组织或衍生细胞系）STR基因分型数据进行比对： 1 若两者的匹配度≥80%，则判定受检细胞系为标准细胞系或为标准细胞系的衍生细胞系。 2 若两者的匹配度在56%-80%之间，建议结合细胞系形态、细胞系特异性标记物等辅助分析进行综合判断。 3 若两者的匹配度≤56