(33)--3.5.2亲和层析技术简介生物制药工艺学.doc

第二节 亲和层析技术简介 亲和层析技术是亲和纯化技术当中发展最为成熟的代表性技术，下面我们来学习一下有关亲和层析的相关知识。 亲和层析是利用生物中多数大分子物质，具有与某些相应的分子专一性可逆结合的特性，而建立的分离纯化技术。适用于从成分复杂且杂质含量远大于目标物的混合物中提取目标物，还可以根据其生物功能，将有活性与无活性的目标物分开，是生物产物分离纯化的常用技术之一。亲和层析具有操作简便，设备简单，适用范围广，特异性强，分离速度快，分离效果好，分离条件温和等优点。但亲和吸附剂通用性较差，洗涤条件较苛刻，也成为了他的限制条件。如图所示，亲和层析的设计和过程大致分为三步：首先是配基固定化，选择合适的配基与不溶性的支撑载体偶联或共价结合，生成具有特异性，亲和性的分离介质。然后吸附样品，亲和层析介质选择性吸附酶或其它生物活性物质，杂质与层析介质之间没有亲和作用，不能被吸附而被洗涤去除。最后进行样品解析，选择适宜的条件，使被吸附的亲和介质上的酶或其它生物活性物质解析下来。 载体在亲和层析中的作用是使配基固定化，同时提供了两物质特性结合的空间环境。理想的载体应符合5个条件，一，载体必须能充分功能化，也就是说，在提要具有足够数量的功能基团或能方便引入多个化学活性基团，2，载体必须有较好的理化稳定性和生物惰性，尽量减少非专一性吸附，3，载体必须具有高度的水不溶性和亲水性，这是保证被吸附生物分子稳定性的重要因素之一。4，载体应具有多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过。5，理想的亲和层析载体，外观上因为大小均匀的刚性小球，这样在层析柱中才能保持良好的疏通性。 亲和层析方法中常用的载体包括纤维素，琼脂糖凝胶，葡聚糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶，多孔玻璃珠，壳聚糖等。 亲和配基是亲和介质的重要组成部分，配基的选用主要取决于分离对象。理想的配基应符合三大要求，第一，配基与配体有足够大的亲和力，一般要求亲和势在10的-4次方到10的-8次方之间。第二，配基与配体的结合应是专一的，这样才能保证分离与纯化的效果。第三，配基应具有化学活性，配基分子上须具有与载体偶联的化学基团，使偶联反应尽可能简便，温和。 配基浓度的选择应当适宜，对亲和势比较低的配基，增加配基浓度有利于吸附，当增加配基浓度有困难，而亲和势又较低时，可增加亲和柱的长度来提高吸附率，配基浓度太高，容易使大分子配基上的活性中心相互掩盖，反而使亲和柱吸附力降低。配基浓度太高，也会使吸附力太强，造成洗脱上的困难，另外，随着配基浓度的增加，非专一性吸附也增加，专一性吸附能力降低，理想的配基浓度为1~10微摩每升，并以2微摩每升凝胶为最好。 在一般情况下，亲和结合时配体分子与配基分子，仅有一部分发生相互作用，为保证亲和吸附剂有足够大的亲和能力，配基固定化使其不参与亲和结合的部位与载体进行偶联，制备亲和柱时，应首先选用大分子配基，因为小分子配基可供识别互补的特殊结构较少，一旦偶联到载体上，这种识别的结构更少，不利于亲和结合。配基的类型主要分为特殊配基和通用配基，抗原的抗体，激素的受体，酶的专一抑制剂均属特殊配基，该类配基分离效果好，但性质不稳定，价格昂贵，成本较高。使用通用配基制成的亲和层析介质可用于一类物质的分离提纯，选择性低于特殊配基，但应用范围广泛，使用方便载体活化与偶联 为了提高亲和层析的效果，通常希望固定相的配基与流动相的配体，具有较强的亲和力，然而亲和力的大小，受许多因素的影响，下面我们就来看一下，影响亲和力大小的几个条件。首先，配基的浓度对于亲和力的大小有直接影响，对于低亲和力系统为了取得较好的配体分离效果，必须提高载体上配基的有效浓度。其次，配基与载体不适当的偶联引发生分子结构变化，造成空间位阻，有可能影响两物质间原有的亲和力，此时可选择增加载体与配基间的活动度，减小空间位阻。第三，在多肽或蛋白质等大分子作为配基时，必须控制偶联反应条件，以最少的键与载体连接，这样有利于保证亲和吸附剂具有较大的亲和能力。第四，载体的孔径大小对吸附剂的亲和能力有决定性影响，应选择适宜孔径的载体进行偶联。最后，亲和介质自身的化学微环境对其亲和力也有一定影响。比如低极性基团，会引起非特异性吸附作用，有时会有助于亲和力提高，但有时却有碍于亲和配基与配体的结合。 对亲和层析的概念有了基本的认识后，我们来学习一下亲和层析的吸附与洗脱的知识。 亲和吸附的强弱，除了与亲和吸附剂及配体的性质密切相关外，还与缓冲液的种类，离子强度，PH，温度和层析流速有关，亲和吸附的具体条件需要摸索，无特定规律可循。为了获取理想的分离效果，层析柱，使用前必须充分平衡，流速尽可能慢。造成亲和吸附能力降低，分离效果变差的主要原因是亲和层析中的非专一性作用。 任何具有离子基团的亲和吸附剂，都会影响蛋白质等多聚电解质的洗脱行为，这种相互作