生物药表征-翻译后修饰脱酰胺.docxVIP

— — PAGE 1 — 生物药表征:翻译后修饰脱酰胺  蛋白质中天冬酰胺（Asn）和谷氨酰胺（Gln）残基的非酶催化脱酰胺作为一种特殊的翻译后修饰（PTM）在体内或体外时有发生，可影响蛋白质的结构、稳定性、折叠和聚集等。特别是已知单克隆抗体分子内某些位置的脱酰胺会影响产品的安全性和有效性，因此通常被视为关键质量属性（CQA）。同时，在衰老、神经系统疾病、年龄相关疾病和自身免疫性疾病中，蛋白质脱酰胺化均起着重要的作用。 1.脱酰胺反应过程 以天冬酰胺为例，Asn的脱酰胺反应通过琥珀酰亚胺中间体进行，该中间体在主链氮（在C端侧）攻击天冬酰胺的侧链羧基时形成。琥珀酰亚胺在中性和碱性条件下很容易水解产生Asp或isoAsp（-Asp），其中isoAsp产物以约3:1的比例优先。 脱酰胺有两个相互关联的类型：异构化和外消旋化。异构化是指Asp转化为具有延伸肽主链的isoAsp，但从Asp形成中间产物的速度明显较慢。外消旋是指L-琥珀酰亚胺外消旋为D-琥珀酰亚胺，水解后的产物为D-Asp和D-IsoAsp，因此脱酰胺后可能有四种产物，即L-Asp、L-IsoAsp、D-Asp、D-IsoAsp。  图丨脱酰胺反应过程 2.脱酰胺反应的影响因素 蛋白质的脱酰胺不但与自身结构有关，也与相应的环境相关，如pH、温度、盐离子浓度等。  1）pH值 脱酰胺反应中，碱性条件有利于中间体琥珀酰亚胺的生成。文献报道，随着pH从5.3增加到8.3，IgG1脱酰胺速率总体上也在增加。  2）温度 据报道，随着温度的升高，脱酰胺速率增加，但是缓冲液类型在温度对脱酰胺的影响中起着很重要的作用。文献发现，在40℃下，磷酸钠缓冲液中的Fc脱酰胺速率比Tri-Hcl缓冲液更快，然而在5℃下，这一趋势发生逆转，与磷酸钠相比，Tris HCl中的Fc脱酰胺速度更快[1]。  3）缓冲液 缓冲液对脱酰胺速率的影响可能由于溶液中的OH-的影响，因为解离常数pKa也是随着温度的变化而变化的。  4）蛋白质一级结构 脱酰胺速率取决于相邻氨基酸残基的大小，较小的氨基酸残基减少了初始环化反应的空间位阻及其作为氢键供体的侧链可用性（可能是由于Asn的羰基氧的分子内氢键），使其更亲电，从而对亲核攻击更具反应性。因此，甘氨酸是促进脱酰胺作用最有利的氨基酸，其次是丝氨酸，而脯氨酸是最不利脱酰胺反应的氨基酸残基。  5）蛋白质高级结构 脱酰胺作用不仅取决于蛋白质的一级结构，还取决于其三维结构。文献报告，在IgG1中，七个Asn残基中只有两个（Asn54和Asn56）对脱酰胺反应敏感，这种差异是由于连续残基的构象动力学导致的[2]。另外抗原-抗体复合物的脱酰胺反应不会导致异天冬氨酸的形成，这表明抗原-抗体复合物可防止来自特定方向的水的攻击，这很可能是由于抗原与抗体结合时的空间位阻或局部构象变化[3]。 3.脱酰胺反应的表征方法 脱酰胺产物的表征是复杂的，因为该反应产生四种不同的Asp异构体，包括L-Asp和L-isoAsp以及不太常见的D-Asp、D-IsoAsp。所有脱酰胺产物都给蛋白质带来负电荷，每个异构体以不同的方式影响结构和功能。 脱酰胺表征的方法有很多，如下表所示，不同方法各有优缺点。IEF基于等电点分离，因此仍然是鉴定脱酰胺作用的常用技术。然而，它的灵敏度、特异性和准确性较低。CZE、CE和IEX-HPLC根据电荷异质性分离脱酰胺产物，而RP-HPLC根据疏水性或极性变化分离。CE和HPLC的主要局限性是灵敏度低和检测限高（即约为总蛋白质的1%），但它通常用于制药行业的常规质量控制。 基于质谱的分析（LC-MS或LC-MS/MS）具有更高的灵敏度，是检测PTM的金标准。脱酰胺反应导致质量增加约+1 Da，这很容易通过灵敏的MS方法检测到。但是质谱的样品前处理过程很可能引入人为脱酰胺反应，因此在前处理过程中需优化条件，减少样品在实验过程中发生脱酰胺反应导致的假阳性。文献报道，曲妥珠单抗血浆样品在37C、pH 7条件下消化三小时，消化效率合理（80%），并且消化过程中形成的脱酰胺产物最少（1%）[4]。  表:脱酰胺表征方法对比[5] 4.脱酰胺对稳定性、活性、免疫原性的影响 脱酰胺可改变抗体的结构和功能，从而影响稳定性、活性和免疫原性。由于残基电荷从中性变为负，脱酰胺反应最终导致蛋白质等电点（pI）降低，这种降解反应导致蛋白质产物中的电荷异质性。脱酰胺反应使得产品中存在脱酰胺和非脱酰胺的混合物，这种脱酰胺变体通常被称为酸性蛋白变体。已经证明，电荷异质性可以通过影响FcRn-IgG离解来改变单克隆抗体的药代动力学（PK）。此外，酸性电荷变体影响单克隆抗体的抗增殖活性和稳定性。 脱酰胺反应对活性的影响与其在蛋白质中的位置