分子检测技术及应用简介.pptx

分子检测技术及应用简介市场部产品经理 目前临床分子病理检测技术及其作用EGFR、KRAS等基因的点突变、插入、缺失无法检测未知缺失ARMS/Sanger测序ALK、ROS1、RET融合，Met扩增 依赖人工判断，主观性强IHC分子病理诊断ALK、ROS1、RET融合，Met扩增 依赖人工判断，主观性强FISH 多基因多种变异形式平行检测NGS基因/位点分子通路国内传统检测方法价格（元）灵敏度EGFR基因18-21外显子突变EGFRARMS PCR1000/2位点5-10%Sanger测序300/位点30%ALK基因融合ALKFISH/ARMS1000-30005-10%ALK基因融合并携带特定点突变ALK无法检测————MET基因扩增METFISH1000-3000——免疫组化（IHC）300——ROS1基因融合ROSRT-PCR————KRAS基因2、3、4外显子激活突变RAS-RAF-MEK-ERKSanger测序300/位点30%NRAS基因2、3、4外显子激活突变Sanger测序300/位点30%BRAF基因V600E激活突变Sanger测序300/位点30%BRAF基因15外显子其他激活突变无法检测————MEK1基因特定激活突变无法检测————PIK3CA基因9、20外显子激活突变PI3K-AKTSanger测序无法检测300/位点——30%——传统检测无法一次全面、准确地展现肺癌相关基因突变，可能造成治疗方案非最优化并且多次检测价格昂贵、样本需要量大、时间长、无法分析上下游通路2017-2-142017-2-142017-4-132017-4-13案例：NGS覆盖ARMS-PCR漏检敏感突变燃石案例：NGS检出exon 21 L833V, 阿法替尼治疗获得PRARMS-PCR未报告exon 21突变NGS检出exon 21 L833V该突变TCGA记录在肺腺癌致癌热点突变, 推荐1、2代TKI治疗服用阿法替尼2月，疗效评价PRARMS-PCR仅覆盖EGFR的29个热点，产生对EGFR敏感突变漏检Exon 19: 仅检测19种亚型，均为以E746或L747为起点的缺失Exon 20: 漏检A763_Y764ins, 此位点对EGFR TKI的RR=67%Exon 21: 仅覆盖2个位点，漏检L833V等文献报道EGFR TKI可能有效的位点ARMS-PCR覆盖29个EGFR位点L833V突变患者服用阿法替尼前后CT对照外显子覆盖位点位点举例exon 183G719A、G719S…exon 1919L747_P753S…exon 205T790M、S768I…exon 212L858R、L861Q…Data on file分子检测技术概述-NGS技术Illumina测序原理Ion torrent测序仪原理华大基因测序仪原理各平台测序仪比较测序按照目标区域大小的分类多 全基因组测序（WGS）涵盖基因突变种类与数量3G 全外显子组测序（WES）临床应用的最佳选择30M少 目标区域富集NGS低高灵敏度300KB靶向测序的NGS检测流程组织/白细胞基因组片段化DNA提取APCKRASEGFR对感兴趣的基因/区域进行富集建库数据分析与突变解读测序上机建库：探针捕获的靶向序列流程1）使基因组DNA片段化，并构建预文库。12）使用有链酶亲合素标记的核酸探针与文库杂交，结合目标区域。加入带有生物素的磁珠。23）使用磁场捕获与磁珠连接的DNA片段。344）纯化和扩增捕获到的片段，并进行二代测序。测序：Illumina测序仪测序流程模板制备： 信号放大的过程 （桥式PCR）1Cluster Generation测序（边合成边测序）2Sequencing数据处理3Data Analysis模版制备：簇生成过程及结果簇生成结果-信号放大Each cluster represents thousands of copies of the same DNA strand in a 1–2 micron spotClusters are bright spots on an imageAmplified Clonal ClusterSingle DNA LibraryIllumina边合成边测序原理Incorporated FI-NTP imagedTerminator fluorescent dye cleaved from FI-NTPAdd 4 Fl-NTP’s + PolymeraseX 36–251Illumina边合成边测序原理All 4 nucleotides in 1 reactionHigher accuracyNo problems with homopolymer repeatsNext CycleIncorporatio