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分子生物学new分子生物学研究方法第1页/共70页 分子生物学技术体系一. 基本技术二. 基因及产物 分子检测技术三. 基因及产物 获取技术四. 基因 功能研究技术第2页/共70页 一. 基本技术1. 琼脂糖凝胶电泳2. SDS电泳PCR技术细菌转化第3页/共70页 1.琼脂糖凝胶电泳1、原理：2、用途：第4页/共70页 琼脂糖凝胶电泳的原理 1. DNA电泳迁移：电荷效应＋分子筛效益 （1）DNA带负电，电场中，向正极移动； （2）决定移动速度三因素：DNA大小，电荷数，构型； ( 3) 线性DNA分子移动速度与其分子质量的对数成反比； （分子量越大，跑得越慢） 2、检测原理： （1）溴化乙锭（EB）可插入双链DNA分子中，在紫外光照射下，发射荧光。第5页/共70页 琼脂糖凝胶电泳用途1. DNA分子量测定（距离－分子量）2. 基因，克隆的鉴定（通过1完成）3、不同长度的基因片断的分离4、DNA浓度的测定 （荧光的强度与DNA含量成正比）第6页/共70页 加标准分子量DNA Marker,测定分子量加标准浓度的DNA，测定浓度第7页/共70页 2. SDS电泳1、原理2、用途第8页/共70页 SDS电泳原理1.SDS(带负电)和还原剂破坏蛋白的高级结构, 同时SDS与蛋白定量结合, 消除蛋白之间的电荷差异,使得蛋白的迁移率主要依赖分子量 (分子小跑得快) .2.不连续电泳: 上层为浓缩胶,可将样品压缩到同一起跑线, 下层为分离胶; 可获得更高的分辨率.3.考马斯亮蓝进行染色.第9页/共70页 第10页/共70页 第11页/共70页 SDS电泳用途1.蛋白分子量的测定2.蛋白浓度的测定3.蛋白的鉴定(通过1来实现)第12页/共70页 3. PCR(聚合酶链式反应) 技术 PCR的基本原理变性、复性、半保留复制 PCR三步曲变性 90～97℃退火 45～55℃延伸 72℃第13页/共70页 PCR第14页/共70页 4. 细菌转化通常情况下，外源基因无法进入细菌细胞内；当用电击法，或CaCl2，或RuCl等方法处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源基因进入的感受态细胞。感受态细胞的活性较低，处理需温柔。第15页/共70页 二. 基因及产物 分子检测技术 定性, 定量, 定位1. DNA (分子量和序列 )(1)(酶切)电泳; (2) PCR; (3)Southern blot; (4) 染色体原位杂交 (5)测序; 2. RNA (序列)(1)RT-PCR (2) Northern blot (3) RNA原位杂交 (4) DNA芯片技术 ;(5)基因表达系列分析技术（SAGE)3. 蛋白(分子量, 结合特性, 酶学特性)(1)SDS; (2)质谱技术; (3)Western blot; (4) ELISA; (5)蛋白芯片技术; (6)免疫组化 (7) EMSA; (8)免疫共沉淀技术 CoIP; (9)蛋白质磷酸化分析第16页/共70页 Southern blot名称检测对象探针检测原理处理过程用途Southern blotDNA标记单链核酸核酸复性中碱基配对专一性琼脂糖电泳后转膜基因检测（拷贝数）Northern blotRNA标记单链核酸核酸复性中碱基配对专一性变性琼脂糖电泳后转膜基因表达的检测（表达量）Western blot蛋白抗体抗原－抗体特异性结合SDS后转膜基因表达产物――蛋白的检测DNA检测第17页/共70页 Southern blotSouthern blot第18页/共70页 原位杂交技术通过标记的核酸探针, 在组织,细胞,间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段.(1) RNA原位杂交组织切片中,该基因的表达产物(mRNA)在细胞水平上作出定性定量分析.-?{区别 免疫组化(蛋白)} (2) 染色体原位杂交eg. 荧光原位杂交(FISH), 确定DNA序列染色体上的位置. DNA / RNA 检测第19页/共70页 第20页/共70页 双脱氧法测序(Dudeoxy sequence analyses)双脱氧法又称末端终止法，用于单链测序1.原理： Atkinson发现用 DNA pol 合成DNA时如在反 应物中加入一定量的 2`,3`ddTTP 时，因ddT 的3`碳原子不含－OH,故DNA不能延伸。 1982年Sanger 利用此原理建立了双脱氧测序法。原理和加减法相似，但不再是加一种dNTP或减一种dNTP,而是